亚砷酸盐诱导盐藻巯基物质含量变化的研究
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料及培养条件2
1.2 试验设计2
1.3 测定项目与方法2
1.3.1盐藻细胞72hOD值2
1.3.2 盐藻吸收砷量和总富集砷量2
1.3.3 盐藻内砷形态2
1.3.4盐藻内NPT、GSH和PC含量2
2 结果与分析3
2.1 不同条件下盐藻细胞生长情况 3
2.2 盐藻对砷的吸收和吸附3
2.3 盐藻细胞内砷形态4
2.4 盐藻细胞内NPT、GSH和PC含量4
3 讨论 5
致谢5
参考文献6
亚砷酸盐诱导盐藻巯基物质含量变化的研究
引言
引言
砷是一种有毒的元素，能对人体健康产生严重破坏，导致皮肤癌等疾病[1]，盐藻含有巯基物质，对重金属有吸附作用，且对砷有类似的特性，如Simon等[2]报道了杜氏盐藻能富集13.7mg/kg的砷。无机砷被盐藻吸收后，可转化为多种含巯基（SH）的化合物, 如半胱氨酸、谷胱甘肽、植物络合肽、金属硫蛋白和硫氧化蛋白等，它们在盐藻对重金属的耐性中起重要作用。由于砷对SH具有很强的亲和力，砷吸收代谢过程与砷在植物体内的积累和毒害关系受到了广泛关注。如果养殖水体遭受污染，可能导致盐藻从养殖环境中积累大量的砷，威胁保健品安全。研究表明，砷诱导盐藻巯基物质含量变化有着重要意义。目前为止，藻类中砷形态研究
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大部分集中在大型经济藻如紫菜[3]、海带[4]等，还没有砷诱导盐藻巯基物质含量变化的报道[5]。
盐藻（Dunaliella salina）是一种嗜盐的绿色微藻，属绿藻门，绿藻纲，团藻目，盐藻科，盐藻属。盐藻没有细胞壁，细胞外只有一层弹性膜，所以体形变化很大，有梨形、椭圆形、长颈形和纺锤形等。原生质体中央有一个细胞核。前端生出两条等长的鞭毛，鞭毛比细胞长约1/3。细胞长16~24微米，宽10~13微米。盐藻是最耐盐的真核生物，可以在含0.05~5.5mol/L（约32.5%）NaCl的培养液中生存，而且盐藻为广温性，可在4~40℃范围内存活，所以盐藻的分布范围相当广泛。迄今为止，已经有很多联用技术被应用于海藻中As诱导盐藻巯基物质含量变化分析。包括UPLC[6], CEICPMS[7], HPLCICPMS[8]。
巯基是蛋白质和酶的正常成份，主要以半胱氨酸形式存在。由于具有较强还原性，在抗过氧化作用中具有一定意义。众所周知,谷胱甘肽的主要生物学作用是其内半胱氨酸上的活性巯基[9]。重金属中毒时，常通过与巯基结合，从而使含巯基酶因失去这种活性巯基而失活[10]。因此，巯基与砷的络合是盐藻对砷的解毒机制之一，可为砷污染水体的生物修复提供理论依据。但培养基中P水平对盐藻巯基的影响还未见报道。
本文在前人研究的基础上，在 As胁迫前设置不同P处理，研究盐藻的生长情况、盐藻培养液As含量、盐藻吸收和吸附As的含量、非蛋白巯基物质（NPT）以及谷胱甘肽（GSH）含量变化，为以后研究海洋藻类对重金属吸收与代谢提供了理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料及培养条件
盐藻购自山东青岛中国科学院海洋生物种质库。盐藻的培养需使用 f/2 培养基[11]，pH调至7.2，并高压蒸汽灭菌(121℃灭菌 30 min)，盐藻的初始细胞密度为5×104cellmL–1 。培养基盐度为65、光照条件为12 h 光照、12 h黑暗(光强3000lx)、温度白天30℃、晚上25℃、培养时间为13 d。
1．2 试验设计
实验共设置4组盐藻，每组处理200ml盐藻，分别装入1L容量瓶里，前两组处理为加磷，后两组处理为缺磷，分别对第一组和第三组加入112ug/L As(III) 处理，即：第一组为加P不加As处理（+PAs）；第二组为加P加As处理（+P+As）；第三组为缺P不加As处理（PAs）；第四组为缺P加As处理（P+As）。培养3 d 后离心收藻，并收集上清液。每个处理设置三组平行。
1．3 测定项目与方法
1．3．1 盐藻细胞72hOD值
根据培养3d后的盐藻溶液摇匀后，测定OD值。
1．3．2 盐藻吸收砷量和总富集砷量
盐藻培养3d 后，取5ml盐藻离心后每组收集两份上清液并保存，1号和2号用配置好的PBS清洗两次，洗去盐藻吸附的砷量，测定盐藻吸收的砷量；3号用NaCl 清洗两次，清洗盐藻，测定盐藻总富集砷量。最后离心收集盐藻。
取0.5ml 浓硝酸与盐藻电热消解[12]后加入8ml 去离子水、1ml硫脲抗坏血酸和0.5ml HCl 后摇匀。实验共设置两个平行。之后采用原子荧光光谱法测定盐藻中的总砷含量（盐藻富集的总砷含量）。
取上清液100ul，加入8.4ml 去离子水、1ml 硫脲抗坏血酸和0.5ml HCl 后摇匀。实验共设置两个平行。之后采用原子荧光光谱法测定盐藻上清液中的总砷含量。1．3．3 1．3．3 盐藻内砷形态
待测盐藻中加入1%浓硝酸1ml摇匀后超声10min，离心10min后再超声10min离心10min，之后采用高效液相色谱法（HPLC）测定，HPLC优化后的检测条件为流动相为17.5mmol/L6.1，等度洗脱；进样体积100ul；载流：5％盐酸；还原剂：1.5％的硼氢化钾和0.5％的氢氧化钾；屏蔽气：700mL/min；载气：Ar，600mL/min；光电倍增管电压：270V；灯电流：100mA
1．3．4 盐藻内NPT、GSH和PC含量
将保存的固体状盐藻样品取出，加4 ml 5 % 磺基水杨酸（SSA）冰浴研磨，12000 g离心15 min( 4 ℃)，上清液定容至10 mL，分装保存。
NPT含量测定：参照Rama和Prasad[13]提出的方法，反应体系为：1 mL上清液、1.85 mL0.2 mol/L TrisHCl ( pH 8.2 )、0.15 mL10mmol/ L5 , 5’双二硫(2硝基苯甲酸，DTNB)，反应20 min后用多功能酶标仪（TECAN InfiniteM200）于412 nm处测定吸光值，以不加DTNB为空白。以GSH为S H标样，做标准曲线。
GSH含量测定：根据荧光法[14]进行测定，取0.5 mL上清液,，加入115 mL PBS( pH 8.0含5 mmol/LEDTA），用NaOH调节混合物至pH为8.0；取上述混合物 0.5 mL，加入114 mL 0.1 mol/ L的PBS( pH8.0)和100uL OPT（邻苯二甲醛，0.1 % ），室温反应 15~20min，用酶标仪（TECAN InfiniteM200）测定样品荧光值，激发波长为350 nm, 发射波长为420nm。
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