摘要：随着工农业的发展和含砷化学物质的不断应用，砷污染已成为一个世界性的严重问题，土壤、大气和水体中的砷污染也正危胁着作物生产和人类的健康。作为植物分子生物学研究模式植物的拟南芥，在植物砷的吸收、转运机制研究方面非常重要。本实验在拟南芥植物螯合肽基因突变体cad1-3的基础上进行EMS诱变，筛选突变体库寻找到两株对五价砷敏感的突变体。实验结果表明：两个突变体的突变基因参与了五价砷的解毒，基因突变造成解毒功能的丧失。同时两个突变体对五价砷和三价砷胁迫表现出的敏感现象，而对镉胁迫不产生敏感现象，说明两个突变体的突变基因都是和五价砷和三价砷的解毒有关，而和镉的解毒无关。两个突变体在不加砷时表型不同，说明两个突变体的突变基因不同。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.2 初筛方法 2
1.2.1 五价砷胁迫处理初筛拟南芥cad13突变体库 2
1.2.2 疑似突变体的恢复和土培2
1.2.3 复筛拟南芥突变体并进行砷胁迫处理2
1.2.4 培养拟南芥突变体进行五价砷、三价砷、镉浓度梯度处理2
1.2.5 培养拟南芥突变体进行水培实验2
1.3 测定方法 2
1.4 数据处理 2
2 结果与分析 3
2.1 两个敏感突变体对五价砷胁迫的反应 3
2.2 两个敏感突变体对其他重金属胁迫的反应 4
2.2.1 两个突变体在五价砷浓度梯度处理下的反应4
2.2.2 两个突变体在三价砷浓度梯度处理下的反应6
2.2.3 两个突变体在镉浓度梯度处理下的反应7
2.3 两个敏感突变体吸收五价砷能力的比较 8
2.3.1 两个敏感突变体在砷处理下的地上部砷含量8
2.3.2 两个敏感突变体在砷处理下的根部砷含量8
2.3.3 两个敏感突变体在砷处理下的地上部与根部砷含量比较 10
2.4 两个敏感突变体吸收磷能
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力的比较10
2.4.1 两个敏感突变体在砷处理下的地上部磷含量 10
2.4.2 两个敏感突变体在砷处理下的根部磷含量 10
2.4.3 两个敏感突变体在砷处理下的地上部与根部磷含量比较 11
3 讨论11
3.1 筛选并确定两株对五价砷敏感的突变体 11
3.2 两株突变体对三价砷和镉的敏感性分析12
3.3 两株突变体对五价砷和磷吸收能力分析12
4 展望 12
致谢 13
参考文献 13
拟南芥五价砷敏感突变体的筛选及相关研究
引言
引言 砷（As）是对人和动植物毒性最大的重金属元素之一，随着工农业的发展,工业三废排放、矿产开采，导致部分土壤和水体的砷含量剧增。砷污染已经成为一个世界性的严重问题，土壤、大气和水体中的砷污染也正危胁着作物生产和人类的健康。含砷物质具有致癌性，能通过饮水和食物进入人体[1]。因此，研究植物砷的吸收和转运机制，减少或消除砷的污染和毒害成为一个亟待解决的重要课题。拟南芥是研究植物代谢机制方面重要的模式植物，因此，以拟南芥为实验材料研究其对砷的吸收、代谢、解毒机制，对之后研究水稻对砷的代谢过程具有重要借鉴意义。
砷在土壤中主要以五价砷和三价砷形态存在，二者能随土壤pH、Eh的变化而相互转化，在旱地情况下，砷主要以五价砷形态存在；在水田厌氧情况下，砷主要以三价砷形态存在。同时无机砷能被土壤中微生物经甲基化作用转化为不同形态的有机砷，不同形态的砷能通过不同机制被植物吸收[2]。
有研究表明，在化学离子结构上，砷酸根和磷酸根具有类似性，砷酸根可通过磷酸根转运蛋白被植物吸收，因此两种离子在被植物根部吸收时，它们之间存在竞争关系[3]。五价砷在植物体内的代谢解毒过程为：五价砷通过磷吸收通道进入细胞后，在砷酸还原酶的作用下被GSH还原成三价砷，三价砷被特异性的膜蛋白泵出细胞或被植物螯合肽结合而后转运到液泡中，从而达到砷解毒的效果[4]。而这种形态转化存在于许多其他植物中[5]。到目前为止，还没有找到专门负责三价砷外排出的膜蛋白[6]。五价砷的还原过程在植物和动物中是普遍存在的[710]，Duan 等发现砷超积累植物蜈蚣草的根提取物有很强的砷还原能力[11]。


NOTE： F. J. Zhao1, J. F. Ma2, A. A. Meharg3 and S. P. McGrath1. Arsenic uptake and metabolism in plants. New Phytologist. (2009) 181: 777–794
植物细胞内的As(Ⅴ)的还原为As（Ⅲ）后，大量As（Ⅲ）就可以通过膜上的蛋白被外排到细胞外，在这一还原过程中GSH具有重要的作用。留在细胞内的三价砷对多肽上的巯基（—SH）具有较高的亲合力, 它的毒性主要是与蛋白质上的（—SH）结合, 从而影响其结构与功能，拟南芥的硫辛酰胺脱氢酶是容易被三价砷钝化的敏感靶位。植物解除三价砷毒性的一条重要途径就是合成富含巯基的多肽, 如GSH和植物络合素（PCS）会与三价砷络合，络合物会被区室化到液泡中，使三价砷失去毒性。
因此，可以看到在五价砷植物体内代谢的过程中，GSH和植物络合素（PCS）具有重要作用。植物体合成GSH和植物络合素（PCS）涉及到两个重要的基因：CAD13和CAD21。CAD21基因负责编码的γ谷氨酰半胱氨酸合成酶是催化谷胱甘肽（GSH）合成的重要基因，该基因突变会导致体内GSH合成量下降，突变体对重金属镉、砷的耐性降低；CAD13基因编码的植物螯合肽合成酶是催化植物螯合肽合成的重要基因，CAD13基因突变体内PC含量会降低，并且也会对重金属镉、砷的耐性降低。为了了解更多关于植物体内砷的解毒过程，我们对CAD13基因突变体进行诱变，建立突变体库，然后筛选对五价砷敏感的突变体。希望能在cad13突变的基础上，找到更多涉及到砷解毒的基因。
材料与方法
1．1 材料
植物材料：EMS诱变处理的拟南芥cad13突变体库。
1．2 筛选方法
1．2．1 五价砷胁迫处理初筛拟南芥cad13突变体库 将拟南芥突变体种子浸泡春化3d后消毒，然后将种子点到含有2μM五价砷的1/2MS培养基上，在22℃／14h光照和22℃／8h黑暗培养条件，培养8d后将根长、叶片颜色、叶片大小表现异常的突变株作为疑似突变体筛选出来。

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