青霉素和红霉素对雌激素降解功能菌降解效率的影响探究
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1．1 实验材料 4
1．1．1 雌激素污染物 4
1．1．2 雌激素降解菌 5
1．2 实验仪器与试剂 5
1．2．1 实验仪器 5
1．2．2 基本试剂 5
1．2．3 培养基 6
1．3 降解菌E2S鉴定 6
1．3．1 细菌培养与菌落观察 6
1．3．2 16S rRNA序列鉴定及系统发育树建立 7
1．4 降解菌E2S降解性能的测定 7
1．4．1 降解菌的富集培养 7
1．4．2 菌悬液的制备 7
1．4．3 测定降解菌E2S的生长曲线 7
1．4．4 测定降解菌E2S的降解曲线 7
1．5 抗生素抑菌性能测定 8
1．5．1 药敏片法测定抗生素抑菌圈大小 8
1．5．2 琼脂稀释法测定最低抑菌浓度 8
1．6 数据处理 9
2 结果与分析 9
2．1 测定与观察 9
2．1．1 菌体形态大小的观察 9
2．1．2 16S rRNA 同源性序列分析 10<
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br /> 2．2 数据分析 10
2．2．1 E2S降解菌的生长曲线 10
2．2．2 E2S降解菌降解E2的降解曲线 11
2．2．3 菌株药物敏感判定 12
2．2．4 低浓度条件下抗生素对E2降解的影响 12
2．2．5 高浓度条件下抗生素对E2降解的影响 13
3 讨论 13
3．1 实验结论 13
3．2 研究展望 14
致谢 14
参考文献 15
附录 16
青霉素和红霉素对雌激素降解功能菌降解效率的影响探究
引言
在我国养殖业中，畜禽粪便的排放量十分庞大。据调查统计并估算，2003年我国畜禽粪便产生量已达22.1亿吨，到2010年，全国畜禽粪便产生量高达45亿吨[2]。如此大量的畜禽粪便，目前主要的出路是作为有机肥还田[3]。然而，源于畜禽动物正常的生理分泌排泄以及促生长素的大量使用，畜禽粪便中含有高剂量的雌激素污染物。例如，肉鸡鸡粪中E1和17βE2的总含量为14~65ug/kg，蛋鸡鸡粪则最高达533ug/kg，新鲜牛粪中的雌激素浓度高达2103g/kg [4]。
大量的雌激素被通过多种形式排放到天然水体、土壤等环境中，造成了严重的污染问题，也对人类和其他生物的正常生存与发展带来破坏，基于此，本课题在初期分离、筛选了一系列具有高效降解畜禽粪便中雌激素的功能菌株，现在在课题基础上优化降解菌的降解条件，研究抗生素对其降解效率的影响，并以青霉素和红霉素这两种典型的抗生素作为实验对象，开展一系列实验。通过本课题实验，拟找到抗生素对雌激素降解菌的最低抑菌浓度，并在此浓度基础上研究抗生素对降解效率的影响程度。
抗生素有很多种类，且对细菌的作用机制主要有四种，其中，青霉素属于β内酰胺类抗生素，作用机制是与青霉素结合蛋白PBPS结合，抑制转肽酶作用，阻碍肽聚糖的交叉联合，导致细菌细胞壁破损，丧失屏障作用，使细菌细胞肿胀变形，最终破裂而死亡。红霉素属于大环内酯类，作用机制主要是与核糖核蛋白体的50S亚单位相结合，抑制细菌蛋白质的合成。选择这两种常见易得且作用机制不同的抗生素，有助于加快研究进度，同时在此经验及结论基础上进行推广实验，可以得到其他抗生素对雌激素降解菌的影响。
17β雌二醇（E2）作为雌激素中的代表污染物，被选作本次实验的实验对象。E2 进入水环境通过自然水体的流动或者污水处理厂，由于现有的污水处理工艺不能直接有效地去除此激素类物质，而人类自身合成的E2，可由排泄物直接排入水体或进入污水处理厂，因而在处理后的出水中仍含有较高浓度的E2[5]。土壤中的E2来源于动物粪便，这些畜禽排泄物被用作农田肥料，由此带入土壤环境。其中大部分的E2 经过雨水的冲刷和淋洗，随径流进入地表水中，剩余的一部分则透过土壤进入到地下水中, 还残留一小部分在土壤中[6]。
降解污染物有多种途径，其中利用微生物自身的代谢过程来降解，具有诸多优势，例如运行成本低、无二次污染、绿色环保等。目前能够降解E2的微生物菌种资源并不是非常多。根据Servos等人[7]的研究，在好氧间歇式反应器的实验中，雌二醇和雌酮的降解效率虽然在24h内可达95%以上，但是经过120h后，仍能检测出雌酮。
根据以往的调查统计显示，研究人员已获得一些E2的系列降解菌。例如：Yoshimoto T等人[6]从污水处理厂中分离得到了能够降解E1，E2，E3和EE2的红球属菌株( Rhodococcus zopfii和Rhodococcus equi )。Yu等人分离出14株降解菌E2S，分别属于Aminobacter、Brevundimonas、Flavobacterium、Nocardioides、Sphingomonas[7]。不过，目前国内关于降解菌E2S的报道相对较少，许多高校的研究范围和方向仅限于在已发现的降解菌中做后续的条件优化实验。
开展该课题研究，可以优化降解菌对畜禽粪便中雌激素的降解工艺条件，从而形成一整套技术体系，高效利用微生物菌剂降解养殖业畜禽粪便中的雌激素。在科技进步、经济增速和社会发展方面有重要的理论和实践意义。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 雌激素污染物
本实验使用的污染物雌二醇浓度为10000ppm，称取100mg雌二醇溶于10ml甲醇中，定容后置于4℃冰箱中避光保存。
1．1．2 雌激素降解菌
降解菌E2S的驯化：由于E2只溶于有机溶剂，所以先将E2加入到事先备好的甲醇溶液中，将其溶解，再倒入100mL的无机盐培养基中，使混合溶液的最终浓度为 1mg/L。在水浴条件下加热，将甲醇溶液完全蒸发[8]。再将采集的污泥加入到该培养基中，接种量按体积分数为 20%计算。放入 30℃，150rmin1条件下，恒温摇床培养。每23d更换一次营养液，重复更换操作8周，实现降解菌的富集，淘汰对E2 敏感的微生物。驯化结束以后，准备一些以LB为碳源的琼脂平板，在平板上多次划线，分离培养，直到得到可以降解E2的单菌落[9]，将其命名为E2S。
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