摘要：独脚金内酯(SLs)及其衍生物是最近被确认为调节根系发展的植物激素。本研究检验SLs是否有调解水稻(Oryza sativa)不定根(ARs)生长的作用，并探讨独角金内酯与生长素之间可能的相互作用。野生型(WT),SL-deficient(d10)和SL-insensitive(d3)水稻突变体在生长素分布实验中被用来研究不定根发育，实验考虑DR5::GUS活跃度、[3H] IAA运输和相关的生长素转运蛋白基因的表达。通过观察外源施用GR24(一种合成的SL类似物),NAA(a-naph-thylacetic酸,外源生长素)和NPA(N-1-naphthylphalamic酸、生长素极性运输抑制剂)对水稻的影响研究水稻幼苗不定根的发育。缺失SL生物合成和信号转导的水稻d 突变体比野生型的不定根量少。同时施用GR24，d10突变体不定根数量和平均不定根数量在每个分蘖处增加, d3则不增加。这些结果表明,水稻不定根生长受SLs调节。内源IAA浓度更高,d 突变体中DR5::GUS和[3H] IAA越活跃。外源GR24施用减少DR5::GUS的表达，可能表明SLs通过抑制生长素极性运输调节不定根形成。无论外源施用 NAA 还是 NPA ，野生型、d10和d3突变体都有相似的DR5::GUS表达；但野生型的不定根数目比 d 突变体的多。实验结果表明，AR的形成由SLs的D3反应通路正向调控。对野生型施用NAA的正向效果和施用NPA的反向效果也表明生长素对不定根生长的重要性，但生长素和独脚金内酯之间的相互作用非常复杂。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words 4
引言4
1 材料与方法5
1.1 材料及生长条件5
1.2 根系形态分析6
1.3 IAA 定量分析6
1.4 [3 H]IAA 极性运输6
1.5 qRTPCR 反应6
1.6 数据分析6
2 结论7
2.1 独脚金内酯突变体不定根数的变化7
2.2 外源供应GR24对独脚金内酯突变体不定根发生的影响 9
2.3 独脚金内酯突变体 d10 和 d3 体内生
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长素浓度的变化 10
2.4 独角金内酯对 PIN 家族基因表达的影响11
2.5 外源供应 NAA 和 NPA 对不定根发生的影响 12
3 讨论 13
致谢 15
参考文献 15
附录 18
补充数据表 1 18
补充数据图 1 19
补充数据图 2 20
补充数据图 3 21
独脚金内酯参与水稻不定根发育的机制研究
引言
引言
根系对植物有效吸收养分和水分是最重要的。与主根系的植物相比，单子叶谷物类的根系几乎全部由复杂的纤维系统和大量的不定根组成。但是由于不定根是由植物茎基胚后发育而来，受环境的影响大；且缺乏统一的形态学指标，因此植物不定根生长发育的生理和分子机制目前并不清楚[5,8]。尽管如此，全面了解不定根发育对调控根系构型应有重大意义，也有助于提高粮食产量和更好地利用农业土地资源。
有些植物激比如生长素对控制不定根形成起到非常关键的作用[8,12]。吲哚乙酸是生长素的主要有效成分，它同时诱导不定根和侧根的发生。生长素主要在芽尖和幼叶中合成[22]，而且通过生长素运输蛋白例如 PIN 家族和 ABCB/PGP 家族蛋白在植物体内的重新分配[3,9,34,24]。在水稻中，改变 PIN1b 的表达能影响不定根的发育[33]。一些水稻中的生长素相关的突变体显示出不定根发育有缺陷。比如，CRL1/ARL1 (一个 AS2/LOB 的转录因子)一个在生长素信号通路下游的控制IAA 和ADP 糖基化的调控因子，对不定根有正向调控作用。crl1/arl1的突变体被证实抑制侧根生长[10,20]。水稻 CROWN ROOTLESS4 (CRL4)/OsGNOM1 的突变体通过调整 PIN 基因的表达影响不定根的发生和发育[16,21]。以前的研究证明，不定根形成受到与生长素相关的因素比如运输、代谢、游离 IAA的存在的影响[7,9]。除此之外的信号通路可能参与诱导不定根的调控。
除生长素之外，研究还表明独脚金内酯以及它的衍生物对根系发育有重要作用[14,18,26,27,29]。在适合生长的条件下施加 GR24（一种合成的独脚金内酯类似物）植物能够依靠 MAX2途径促进植物主根的伸长。在 MAX2 独立模式中，施加高剂量的 GR24会观察到主根长度被抑制[27]。拟南芥和豌豆中缺乏独脚金内酯响应的突变体（thaliana 和 pea）促进不定根的发育，也就是说，独脚金内酯在这两个品种中抑制不定根的形成。Arite等发现独脚金内酯促进水稻不定根的伸长[1]。独角金内酯缺乏或感应迟钝的拟南芥和番茄突变体，其侧根密度增加，证明独脚金内酯能影响侧根发生[15,18,27]。对比双子叶植物拟南芥和番茄的研究结果，生长14天的野生型种子根的侧根数与 d10和d14突变体没有差别[1]。这些结果表明，独脚金内酯作为一种植物激素在调节根系生长上有着复杂的生物学机制。
在这个研究中，将采用独脚金内酯缺乏和不敏感的水稻突变体来研究独脚金内酯是如何调控不定根发育的。水稻对独脚金内酯研究是一个理想的研究材料，它有几个非常显著的合成突变体（d10, d17 和 d27）和信号转导突变体（d3, d14 和 d53），这些突变体相比野生型水稻会减少不定根的发育[13,30,32,37]。给 d10突变体外源施加 GR24可以修复不定根发育，但在信号转导突变体d3上就没有。此外，通过测定植物体内源 IAA 浓度，携带DR5::GUS报告基因的生长素转运蛋白的突变体，放射性同位素标记 IAA 极性运输，施加外源生长素 NAA 和生长素极性运输抑制剂 NPA ，都表明水稻中不定根发育受到体内独脚金内酯和生长素水平的影响。
1 材料与方法
材料及生长条件
供试水稻品种野生型为 shiokari，独脚金内酯合成突变体 d10 和信号转导突变体 d3。种子经 30% H2O2 消毒 30 min,在清水中育苗 7 天，选择地上部及根系大小形态均一致的幼苗，去种子后一次在 1/4、1/3 和 1/2 的营养液中培养 7 天，然后移栽至 pH5. 5的国际水稻所(IRRI)修正营养液培养14天:(mM) 2.5 NH4NO3, 0.35 K2SO4, 1.0 CaCl2, 1.0 MgSO47H2O, 0.5 Na2SiO3 和 (μM) 300 KH2PO4, 20.0 FeEDTA, 9.0 MnCl2, 0.39 (NH4)6Mo7O24, 20.0 H3BO3, 0.77 ZnSO4,0.32 CuSO4。
外源独脚金内酯(GR24)，生长素(NAA)和生长素极性运输抑制剂(NPA)的处理：水稻移栽后,分别在营养液中施加外源独脚金内酯 GR24(05μM)(GR24 用丙酮溶解)，生长素NAA(0500nM)(NAA用1mM NaOH溶解)和生长素极性运输抑制剂 NPA(05μM) [NPA 用 DMSO(二甲基亚砜)溶解]。
根系形态分析
用根系扫描仪(Regent Instruments, Montreal, QC, Canada)测量不定根长度，人工测定分蘖数和不定根数。
IAA定量分析
根茎结合处 IAA 的浓度参考 Song 等[28]。称好新鲜的样品马上用液态氮冷冻，用高效液相色谱检测 IAA 浓度。标准IAA 样品取自SigmaAldrich (St Louis, MO, USA) 。
采用土壤农杆菌转化法将含有 pDR5::GUS 报告基因的表达载体转化到野生型和独脚金内酯突变体体内,通过 GUS 染色的强弱来反应植物组织中生长素的响应 (Hagen et al., 2002)。 将水稻叶片、叶鞘和根茎结合处放入 GUS 溶液，在 37°C下染色 24 小时,再用梯度浓度乙醇进行脱色处理，用体视镜进行观察、CCD 彩色相机(Olympus, Tokyo, Japan)进行拍照。本实验中含有 pDR5::GUS 报告基因的表达载体是由浙江大学吴平教授实验室提供的。

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