摘要：由茄科劳尔氏菌 (Ralstonia solanacearum) 引起的番茄青枯病是番茄上常见的病害之一，各地普遍发生，严重时导致植株青枯死亡，以致减产甚至绝收，很大程度上制约着番茄产业的发展。为防治番茄青枯病过量施用化学农药不仅防治效果差，还带来了食品安全问题和环境的污染，而生物防治为减轻植物病害和保护生态环境提供了新的途径。我们在从青枯病高发地块上健康的番茄植株根系土壤中筛选出一株对番茄青枯菌具有显著拮抗作用的菌株，并研究其生理生化特征及其产生拮抗作用的最佳条件，通过实验证明了该拮抗菌株对番茄青枯病有较好的拮抗作用。
目录
引言 1
1．1 供试材料 2
1．1．1 供试土壤 2
1．1．2 供试病原菌 2
1．1．3 供试植物 2
1．1．4 培养基与试剂 2
1．1．5 实验仪器 2
1．2 实验方法 2
1．2．1 拮抗菌的分离 2
1．2．2 拮抗菌的筛选 2
1．2．3 拮抗菌的鉴定 3
1．2．4 拮抗菌株对抗生素敏感性试验 4
1．2．5 营养及环境条件对菌株生长的影响 4
1．2．6 不同根分泌物添加量下拮抗菌的生长曲线 4
1.3 数据统计与分析 4
2 结果与分析 5
2．1 拮抗菌株分离筛选和鉴定 5
2．1．1 拮抗菌株的形态学特征 5
2．1．2 拮抗菌在贫营养条件下的生长情况 6
2．1．3 拮抗菌株的抗生素敏感性 6
2．1．4 拮抗菌株的 16S rRNA 基因同源性分析 7
2．2目标拮抗菌对青枯菌的拮抗效果 7
2．3不同培养条件下目标拮抗菌的生长测定 8
2．3．1不同碳源对拮抗菌生长的影响 8
2．3．2不同氮源对拮抗菌生长的影响 8
2．3．3不同温度对拮抗菌生长的影响 9
2．3．4不同pH对拮抗菌生长的影响 9
2．3．5不同装液量对拮抗菌生长的影响 10
2．4不同根分泌物添加
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量下拮抗菌的生长曲线 10
3 讨论 11
致谢 12
参考文献 12
附录 17号拮抗菌株的16SrRNA的基因序列 14
番茄青枯病拮抗菌的分离筛选及生物学特性研究
引言
引言
青枯病是番茄、马铃薯、辣椒、茄子等多种茄科蔬菜的一种毁灭性土传病害, 广泛分布于热带、亚热带以及部分温带地区。番茄细菌性青枯病是由茄科劳尔氏菌所引起的[12]，是我国长江流域及以南方各省市及台湾地区番茄生产中最为流行的植物病害之一[3]，发病主要症状是番茄植株迅速萎蔫、枯死。防控青枯病的途径以培育抗性品种、喷施化学农药以及生物防控为主，然而抗性育种培育周期过长，化学农药对环境有不利、危害食品安全，且容易使病菌对药品产生抗性。
生物防治植物土传病害是指有益微生物(真菌、细菌和放线菌等)分泌代谢产物，利用这些代谢产物中对病原菌有拮抗作用的某些物质、诱导植物抗病、与病原菌竞争资源(生态位和营养)等方式来抑制或消灭植物病原菌的一种防治方法。土壤中，尤其是植物根系周围栖息着许多具有生物防治潜力的微生物,在自然条件下由于各方面的限制，据大部分的功能受到不同因素的影响而未被完全开发。由于微生物繁殖速度快的特点，因而可以通过人工繁殖，筛选，甚至诱导变异，提高其种群的数量后将其作为一种土壤的进行,调节根部微生态环境、抑制土传病原菌的繁殖和减少土传病害的发生与加重，显示出巨大的应用潜力[4]。生物防治对环境没有污染与残留人畜安全，符合有机农业、生态农业和可持续农业发展的要求。本研究从番茄种植土壤中获得了许多拮抗菌，通过初筛、复筛和贫营养试验，分离筛选出一株防治效果较好的菌株,同时，我们还对该拮抗菌株进行了鉴定，分析其生理特性以及该拮抗菌株生长的最佳条件。
1 材料与方法
1．1 供试材料
1．1．1 供试土壤
大学麒麟门实验基地耕土
1．1．2 供试病原菌
大学农业资源与环境实验室保存的强致病力青枯病病原菌
1．1．3 供试植物
903品种番茄
1．1．4 培养基与试剂
LB 培养基：蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、NaCl 10.0 g、去离子水1000 mL，pH 7.27.4, 121 ℃灭菌 20 min。
NA 培养基：葡萄糖10.0 g、蛋白胨5.0 g、牛肉膏 3.0 g、酵母粉0.5 g、去离子水 1000 mL，pH 7.27.4, 115 ℃灭菌 30 min。
无机培盐养基（g L1）： （NH4）2SO4 2.00 g、K2HPO43H2O2.00g、NaH2PO4H2O 0.60 g、NaCl 1.00 g、MgCl20.50 g、CaCl20.02g、去离子水 1000 mL，pH 7.07.2，121℃灭菌 20 min。
青枯菌选择性培养基（SMSA）：蛋白胨 10 g、甘油 5mL、酪蛋白水解氨基酸 1g、去离子水 1000 mL，121℃ 高压灭菌 20 min。制平板前在培养基中依次加入抗生素终浓度为：结晶紫 50 µg mL1、1% TTC 50 µg mL1、杆菌肽 20 µg mL1、多粘菌素100 µg mL1、放线菌酮 50 µg mL1、氯霉素 5 µg mL1、青霉素 0.5 µg mL1（French et al., 1995）。
1．1．5 实验仪器
MLS3780型高压蒸汽灭菌锅, GRP9160型隔水式电热恒温培养箱、722N型分光光度计、冷冻离心机及一些常规试验用品。
1．2 实验方法
1．2．1 拮抗菌的分离
用接种环将活化的青枯菌接种至盛有3mL NA液体培养基的试管中，30℃、170 rmin1振荡培养12 h，得到种子液。种子液按1%接种量转接至盛有50 mL LB液体培养基的250 mL三角瓶中，于30℃条件下170 rpm振荡培养2436h，调节菌悬液浓度至1×108 CFU•mL1备用。
在麒麟门实验基地，采集番茄健康植株和发病植株根际周围0~20cm的表层土壤,装入无菌聚乙烯塑料袋,封口。称取5g土壤,加入有玻璃珠的45ml无菌水的三角瓶中,170r/min摇床30min,即成101菌悬液,然后从所得菌悬液中吸取400μL加入有3.6ml无菌水的4ml灭菌离心管中,依次稀释得到102、102、103、 104 、105、106、107 和108的菌悬液。取400μL103、 104 、105、106、107和108的菌悬液均匀涂布于NA平板上,每个稀释度重复6次,然后放在30℃恒温培养箱中培养48h,待菌落出现。然后将制备好的青枯病病原菌菌悬液均匀地喷在培养皿上，继续培养24小时，待拮抗圈出现做好标记，周围有拮抗圈的菌落即为拮抗菌。
1．2．2 拮抗菌的筛选

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