摘要：本研究采用可培养平板计数方法与高通量测序技术相结合，研究了具抑制香蕉土传枯萎病发生（抑病型）蕉园土壤抵御外源病原菌入侵的土壤微生物生态学效应。通过向抑病型蕉园土壤与导病型蕉园土壤中接种不同浓度的病原菌孢子悬液进行室内培养，研究不同处理下不同时间内抑病土壤与导病土壤细菌及真菌群落组成与结构的变化。研究结果表明，抑病型土壤抵御尖孢镰刀菌侵染与微生物有不可分割的关系，抑病型土壤中可培养芽孢杆菌数量显著高于导病型土壤，而可培养尖孢镰刀菌数量显著低于导病型土壤。在浓度为105 个/g（干土，下同）病原菌孢子的入侵下，抑病型及导病型土壤细菌和真菌群落结构明显不同；抑病型土壤中变形菌门、酸杆菌门、拟杆菌门的相对丰度显著高于导病型土壤，而镰刀菌属的相对丰度显著低于导病型土壤。进一步的研究表明，抑病和导病型土壤中的微生物对碳源的利用能力不同。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 3
1.1 试验材料 3
1.1.1 供试菌种 3
1.1.2 供试土壤 3
1.1.3 供试培养基和试剂 3
1.2 试验方法 3
1.2.1可培养微生物涂布计数 3
1.2.2孢子悬液制备 4
1.2.3 尖孢镰刀菌入侵蕉园土壤室内培养实验 4
1.2.4 外接营养源下尖孢镰刀菌入侵蕉园土壤室内培养实验 4
1.3 样品采集 4
1.3.1土壤样品采集 4
1.3.2 土壤总DNA的提取 5
1.3.3土壤细菌及真菌群落高通量测定 5
1.4 数据处理与分析 5
1.4.1生物数据统计分析 5
1.4.2 MiSeq高通量数据基本分析 5
2 结果与分析 5
2.1尖孢镰刀菌入侵蕉园土壤室内培养实验 5
2.1.1 可培养微生物数量变化趋势 5
2.1.2细菌及真菌群落结构分析 6
2.1.3 门水平下不同样品中微生物群落组成的结果比较 7

 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2# 
2.1.4 尖孢镰刀属相对丰度比较 7
2.2外接营养源下尖孢镰刀菌入侵蕉园土壤室内培养实验 8
3 讨论与结论 8
致谢 9
参考文献： 10
附录A 论文发表及专利申报情况 11
香蕉抑病型土壤抑制病原菌侵染研究
引言
引言 香蕉是世界第四大粮食作物，是我国华南地区四大佳果之一，也是世界上著名的热带和亚热带水果。其不仅营养价值丰富，而且茎、花、果、根等都有较高的药用价值。在一些发展中国家，香蕉甚至是主要的食物来源[1]。香蕉在农业生产中具有十分重要的地位并发挥着举足轻重的作用，尤其在亚热带和热带地区的农业生产中更是如此。然而，由于片面追求经济效益，我国蕉园多实行长期连作种植模式，导致香蕉枯萎病发生严重[2]。因此，如何有效防控香蕉枯萎病的发生，维持香蕉产业的可持续发展为当前香蕉行业需要解决的重大命题[3]。
抑病型土壤指的是土壤中病原菌不能够有效定殖，或者即使定殖后，但危害依然很小或没有危害，再或者就是病原菌能后定殖并且造成一时危害，但随后即使存在病原菌发病依然很轻的那类土壤[4]。病原菌需要到达到一定数量，才可能导致发病[5]。因此，研究抑病型土壤抵御病原菌入侵的机制对于香蕉土传枯萎病的防控变得异常重要。目前国内外学者已开始对抑病型土壤微生物区系特性逐步进行解密。大量的研究集中在鉴定与抑病能力相关的微生物类群上，该类微生物能通过竞争生态位、产生抗生素等方式，抑制病原菌增殖或根际侵染[6]。虽然抑病型土壤微生物区系特征解析一直是热点研究方向，但有关香蕉抑病型土壤微生物区系特征解析的研究尚未完全展开。
本实验室团队通过前期在海南省的广泛调查，发现有1处蕉园，连续种植10年以上，而枯萎病发病率一直低于15%。通常认为连作模式下，发病率低于15%的蕉园即为低发枯萎蕉园（以下简称抑病蕉园，其土壤简称抑病土壤），而相邻蕉园发病率高达60%以上（以下简称导病蕉园，其土壤简称导病土壤）。室内前期研究表明此低病蕉园土壤种植的香蕉能形成抑病型根际微生物区系。本论文采用可培养平板计数方法与高通量测序技术相结合，通过不同处理比较导病和抑病土壤对外来入侵病原菌的反应，旨在能够解析抑病土壤微生物抵御病原菌入侵的土壤生态学机理，最终为香蕉枯萎病的防控提供理论支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌种
香蕉土传枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum f.sp. cubense，FOC）：由本实验室从海南香蕉种植园病区发病香蕉植株根际土壤中分离获得，已经通过回接实验确定其致病性，为香蕉土传枯萎病4号生理小种[7]。
1.1.2 供试土壤
室内培养实验所用土壤采自海南天地人生态农业股份有限公司低病蕉园和高病蕉园。
1.1.3 供试培养基和试剂
LB培养基：蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、氯化钠10.0g、琼脂20.0g，蒸馏水1L，定pH到7，121℃高压蒸汽灭菌20 min。
金氏培养基：蛋白胨20.0g、磷酸氢二钾1.5g、硫酸镁1.5g、甘油10ml、琼脂20.0g、pH值7.2±0.2、121℃高压蒸汽灭菌20 min、培养基化开冷却至60度左右加入放线菌酮终浓度100 ug/ml、青霉素终浓度75ug/ml。
K2培养基：磷酸氢二钾1.0g、氯化钾0.5g、硫酸镁0.5g、铁钠EDTA 0.01g、L天门冬酰胺2.0g、D半乳糖20.0g、抗生素类物质：二硝基苯（75%WP）1.0g、牛胆汁0.5 g、Na2B4O710H2O 1.0g硫酸链霉素0.3 g、蒸馏水1000 ml，10 %磷酸调节 pH至3.8±0.2。
PDA培养基：去皮的马铃薯200g，切成12 cm小块，煮沸20 min后用纱布过滤，取滤出液，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1L，115℃高压蒸汽灭菌30 min。
1.2 试验方法
1.2.1可培养微生物涂布计数
称取5 g土壤于45 mL的无菌水中，170 rpm震荡30 min，稀释成101、102、103、104、105等不同梯度稀释液。用无菌吸管各取0.1 mL涂布于选择性培养基平板中，不同梯度各三个平板，尖孢镰刀菌采用K2培养基，假单胞菌采用金氏培养基，芽孢杆菌采用LB培养基。芽孢杆菌涂布之前，将土壤悬液于80℃加热15 min。病原菌于28 ℃培养箱中培养72 h后计数，芽孢杆菌及假单胞菌于30℃培养箱中培养36 h后计数。同时取5 g土壤于铝盒中，放入108 ℃烘箱烘8h，计算含水量。最终土体土壤中可培养微生物数量以每克干土形成的菌落数对数化后的数值Log (CFU g1 dry soil)表示。
1.2.2孢子悬液制备
接种新鲜FOC到PDA平板上，28 ℃暗培养至产孢，用5 ml无菌水轻洗菌面，再经纱布过滤得到孢子悬液，混匀后吸取200 ul孢子悬液到无菌离心管中，血球计数板计数后将孢子原液稀释。

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