分析实验室分离菌株 Cohnella sp. LGH 的全基因组序列，获得一个预测编码琼脂酶的基因，通过PCR扩增技术得到目的基因片段，再通过酶切-酶连将基因连入表达载体，转入感受态细胞中，并在大肠杆菌中进行表达，使用DNS法验证该基因是否编码琼脂酶。纯化后的表达产物经SDS-PAGE检测其相对分子质量、用薄层层析法检测水解产物并测定其酶学性质。结果表明重组酶的相对分子质量为110 kDa；琼脂酶AgaWJ2最适的反应pH为9.0，在pH为 9.0的缓冲液中处于最稳定状态；在45℃反应条件下有最好的酶活力，在温度超过55℃后酶活力急剧下降。琼脂酶AgaWJ2在45℃及以下都有较好的稳定性，超过50℃的条件下，琼脂酶AgaWJ2表现出酶活力大幅下降。Na+、K+、Zn2+、Ca2+和Mn2+对酶解反应无明显影响；Mg2+、Ba2+、Fe3+、Cu2+、SDS和EDTA能明显抑制酶解反应；尿素和DTT能提高酶解反应的效率。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）2
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1材料 2
1.1.2体系、试剂 2
1.2方法 3
1.2.1琼脂酶(agaWJ2)的克隆3
1.2.1.1提取琼脂降解菌 LGH的基因组DNA3
1.2.1.2使用试剂盒提取表达载体pET29a4
1.2.1.3构建PCR体系4
1.2.1.4表达型重组质粒的构建4
1.2.2琼脂糖酶(agaWJ2)基因的转化4
1.2.3琼脂糖酶(agaWJ2)基因的表达4
1.2.4表达产物的功能验证4
1.2.5表达产物的纯化及鉴定 4
1.2.6 SDSPAGE4
1.2.7用薄层层析的方法检测水解产物5
1.2.8重组琼脂酶AgaWJ2酶学性质的研究5
2结果与分析 5
2.1构建携带agaWJ2基因的菌株5
2.2 AgaWJ2的表达和纯化6
2.3 Aga
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WJ2的酶学性质研究6
2.3.1 AgaWJ2的最适pH和pH稳定性7
2.3.2 AgaWJ2的最适温度和温度稳定性7
2.3.3 不同试剂对AgaWJ2的酶解反应影响7
2.3.4 AgaWJ2的酶动力学参数测定8
2.4 AgaWJ2的酶解产物研究9
3讨论 9
3.1琼脂酶AgaWJ2的酶学性质 9
3.2 AgaWJ2的酶解产物鉴定9
致谢10
参考文献10
琼脂酶基因agaWJ2的克隆、表达和酶学性质研究
引言
随着人类对资源的不断探索和利用，陆地资源越来越匮乏，现在人们逐步把目光转移到蕴藏巨量资源的海洋。海洋约占地球总面积的71%[5]，拥有丰富的藻类资源，主要有红藻，蓝藻，硅藻，绿藻等。人们通过物理，化学和生物方法从藻类中提取各种具有价值的物质，琼脂就是其中一种。琼脂也可称作琼胶，是从红藻类海藻中提取的一类天然多糖物质。在实验室里，琼脂作为一种难以降解利用的惰性物质，具有很好的稳定性，常作为培养基的支持介质。得益于其稳定性，在食品工业上琼脂作为增稠剂、稳定剂、悬浮剂、凝固剂和乳化剂等使用，是工业用途最为广泛的海藻胶之一[1~3]。在我国琼脂的生产主要来源于江篱。
琼脂是由具有凝胶性质的琼脂糖（agarose）和非凝胶性质的琼脂胶（agaropectin）构成的混合物，并以琼脂糖为主。琼脂糖的化学构成是由βD半乳糖和3,6内醚αL半乳糖等组成的链状线性聚合物，其中硫酸基的含量低于0.15%[4]。琼脂胶的结构与琼脂糖相似，但3,6内醚αL半乳糖上的羟基被硫酸基、甲氧基、丙酮基等基团替代，硫酸基的含量较高，可达5%8%。硫酸酯和丙酮酸的存在会使凝胶强度减弱，若基团链接在C6上，可通过碱处理或硫酸酯酶的作用脱硫，转化为琼脂糖，提高凝胶强度[13]。
新琼寡糖是琼脂经琼脂酶水解后形成聚合度为2～20的海洋功能性低聚糖，主要由琼脂二糖的重复单位连接而成。琼脂粘度高，不溶于水，难以分解利用，新琼寡糖则有很好的水溶性，易于人体吸收利用。随着研究的不断进展和深入，人们逐渐发现新琼寡糖具有很多有意义的生理功能特性。新琼寡糖具有抗癌症，抗炎症，抗病毒，抗氧化，抗龋齿，预防糖尿病，增殖肠道益生菌和美白保湿等生理功能[8~12]。这表明新琼寡糖在医用药物，保健品，功能饲料和化妆品等方面有着很好的应用前景[5][6]。
目前获得新琼寡糖的主要方法有酸解法和酶解法，而酸解法存在污染大和效率低等缺点，酶解法有着效率高、污染小和反应条件温和等优势，代替酸解法是未来的趋势。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1材料
琼脂降解菌株 Cohnella sp. LGH为本实验室保存
表达载体：pET29a（本实验室保存）
表达菌株：BL21（DE3）plysS（本实验室保存）
引物由invitrogen公司合成
AgaWJ2F: 5’GGggtaccATGATTCTGGTCTTCCTCCTCATGAT3’（Kpn I）
AgaWJ2R: 5’ACGCgtcgacCTACTTCTGTGACAAACGAAGGTTATCG3’（Sal I）
基因组提取试剂盒，质粒提取试剂盒购自Axygen
1.1.2体系、试剂
（1）LB培养基： 琼脂粉 15 g/1L
Yeast Extract 5 g/1L
Nacl 10 g/1L
（2）PCR体系（50 μL）：酶Prime Star max 25 μL
引物AgaWJ2F 1 μL
引物AgaWJ2R 1 μL
DNA 1 μL
无菌水 22 μL
（3）酶切体系（60 μL）：Bμffer(缓冲液) 6 μL

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