长期施肥管理对土壤微生物群落结构的影响
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 材料 4
1.2 方法 4
1.2.1 土样处理4
1.2.2 提取DNA4
1.2.3 微生物基因文库技术4
1.3 技术路线5
2 结果与分析5
2.1 不同施肥处理OTUs交叠Venn 图5
2.2 不同施肥处理物种统计结果6
2.3不同施肥处理的物种优势度指数分析 8
2.4 不同施肥处理的多样性指数分析9
2.5 不同施肥处理的主坐标分析（PCoA）11
3 讨论12
致谢13
参考文献13
长期施肥管理对土壤微生物群落结构的影响
引言
引言
土壤微生物是生态系统中极其重要的角色，它参与土壤有机质分解、腐殖质形成、养分转化等过程，在系统中起了不可或缺的作用[1]。施加氮肥能对土壤微生物尤其是真菌产生十分显著的影响。有研究表明，施加氮肥对菌根真菌有直接的抑制作用，单施氮肥会导致
*景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072*
其他的养分耗竭而不利于真菌生长。但是也有研究证明无机氮肥能够显著促进土壤中真菌的数量，连续两年施肥有利于真菌的生长；真菌会随着施肥量增加先增加后减少，随着施肥时间的增加先增加后减少[2][3]。
为提高作物产量, 满足人类生存需要, 近年来农田施肥量不断增加, 施肥方式也在不断变化。但是由于长期的农业生产, 农田土壤肥力不断下降, 微生物区系也在发生变化, 土壤环境不断恶化[5][6][7]。青藏高原是欧亚大陆最高最大的地貌单元，属于高寒草甸土壤，具有年轻性、脆弱性、敏感性、原始性、典型性等特点，能够更好的对不同氮添加做出反应。
本次研究试通过实验了解土壤微生物真菌多样性与不同氮浓度的关系，为建立合理施肥制度，提高土壤肥力和实现土壤可持续利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 土样
本实验土样来源甘肃省甘南藏族自治州玛曲县施氮处理样地。
不同施肥处理为N0：0g/a/m2氮素、N1：5g/a/m2氮素、N2：10g/a/m2氮素、N3：20g/a/m2氮素（纯氮的重量，施肥为NH4NO3）。
培养时间为4年。
1.1.2 试验试剂以及仪器：
Eppendorf AG 台式高速离心机
涡旋仪
DYYGC型电泳仪
培清JS680D全自动凝胶成像分析仪
PowerSoil DNA Isolation Kit
NanoPhotometer分光光度计
Qubit2.0 Flurometer
BioRAD CFX 96荧光定量PCR仪
1％的琼脂糖电泳
1.2 试验方法
1.2.1 土样处理
将采集好的四种不同施肥处理的土壤新鲜样品标记分类并放于储存室风干，然后将风干后的土壤样品分别磨细并过100目筛之后再用自封袋保存，并注明好土壤类型和日期，便日后测定用。
1.2.2 提取DNA
使用PowerSoil DNA Isolation Kit提取DNA，遵照试剂盒上指示逐步进行。
1.2.3 微生物基因文库技术
将提取出来的DNA样品送至安诺优达基因科技（北京）有限公司，采用高通量测序技术（Illumina），并利用生物信息学分析方法进行快速的物种鉴定。
1.2.3.1 DNA质量检测
1％的琼脂糖电泳检测DNA样品是否有降解以及杂质；NanoPhotometer分光光度计检测样品纯度；Qubit2.0 Flurometer检测DNA样品浓度。
1.2.3.2 18SrDNA文库制备
取用10ng的DNA模板，对目的区域进行扩增：根据测序区域的不同，选择对应区域的扩增引物：V3区引物为338F533R，V3+V4区引物为314F805R，V6区引物为967F1046R；使用TaKaRa的EXtaq酶，确保扩增效率和准确性。继而对扩增出的目的片段进行富集，同时加入特异index序列。
1.2.3.3 库检
文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，使用BioRAD CFX 96荧光定量PCR仪，进行QPCR，对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。
1.2.3.4 测序
检测合格的文库，采用MiSeq进行测序，测序策略为PE250。
1.3 技术路线
图1. 技术路线图
Figure 1. Schematic diagram of research methodology
2 结果与分析
2.1 不同施肥处理OTUs交叠Venn图
OTUs，即分类操作单元，它代表的是一类相似序列的集合，默认将序列相似度大于97% 的Reads归为一类OTUs，认为它们具有相同的物种来源，从中选出代表序列可以简化数据集，以便进行下一步的分析，我们采取的OTUs的挑选策略是拿我们得到的序列与参考数据库中的OTUs序列进行比对，挑选相似度大于97% 的序列归为一类OTUs。
根据每个组间的OTUs交叠情况做出以下Venn图，Venn图统计出每个组共有与特有的OTUs数目情况，可以比较直观的显示组间的OTUs组成的重叠情况。图形结果如下所示：
图2.操作分类单元维恩图
Figure 2.Venn diagram of operational taxonomic unit
如图2所示，N0样品中含真菌种类589个，N2样品中577个，N3样品中含有580个，N1样品中含有529个。N0和N2有相同种类464个，N0和N3有相同种类446个，N0和N1有相同种类442个，N2和N3有相同种类475个，N2和N1有相同种类434个，N3和N1有相同种类433个。N0、N2和N3有相同种类401个，N0、N2和N1有相同种类393个，N0、N3和N1有相同种类379个，N2、N3和N1有相同种类393个，四组处理间有相同种类359个，分别占不同处理真菌种类的60.9%、67.9%、62.2%和61.9%。
原文链接：http://www.jxszl.com/hxycl/hxyhj/51356.html
