兽药和饲料中不合理的抗生素和重金属的添加导致了畜禽粪便中抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Gene，ARG）的产生和重金属的残留。随着我国畜禽养殖业的快速发展，养殖废水中的四环素类抗性基因和重金属对生态环境构成了潜在威胁。养殖废水处理常采用活性污泥工艺，通过好氧、厌氧反应器的交替运行去除各种污染物。本研究利用实时荧光定量PCR技术，考察了在好氧、厌氧生境下Cu2+和Zn2+对活性污泥中四环素类抗性基因（tetA、tetO、tetW）消减的影响，以期为养殖废水中抗生素抗性基因去除技术提供理论基础。实验结果表明与好氧生境相比，厌氧生境会抑制tetA、tetO、tetW的消减。在好氧和厌氧生境下，Cu2+、Zn2+或Cu2+、Zn2+共存都会显著抑制tetO、tetW的消减，Cu2+会显著抑制tetA的消减，而Zn2+对tetA的丰度却无显著影响。
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key Words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1. 1实验设计 4
1. 2主要试剂和仪器 5
1. 3水质参数的测定 5
1. 4 DNA检测方法 5
1. 4. 1活性污泥DNA的提取 5
1. 4. 2 PCR扩增 6
1. 4. 3琼脂糖凝胶电泳检测 6
1. 4. 4建立标准曲线 7
1. 4. 5实时荧光定量PCR 7
2 实验结果与分析 8
2. 1氧化还原电位的测定结果 8
2. 2好氧和厌氧生境对四环素类抗性基因消减的影响 9
2. 3 Cu2+和Zn2+对四环素类抗性基因消减的影响 11
2. 4水质参数分析 14
3 结论 15
致谢 15
参考文献 16
不同氧生境下重金属对四环素类抗性基因消减的影响
引言
抗生素具有杀菌或抑菌作用，除了应用于人类医疗，还作为兽药和饲料添加剂应用于畜禽养殖业，促进畜禽生长、降低畜禽死亡率、改善畜禽繁殖性能[1]。我国每年 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
添加于畜禽饲料中的抗生素约为6000 t，是世界抗生素饲料添加剂总使用量的一半。四环素类抗生素的使用量在我国及世界畜禽养殖业中都居于首位[23]。长期不合理使用抗生素可能导致环境中细菌耐药性增加，抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Gene，ARG）和抗生素耐药菌（Antibiotic Resistance Bacteria，ARB）被认为是污水中广泛存在的新型污染物[1]。ARG可在环境中传播扩散，并可通过水平基因的转移传播耐药性到人类的病原菌，进而威胁人类健康[4]。
四环素类抗生素是一类广谱抑菌剂，可以抑制细菌蛋白质的合成，被广泛应用于畜禽养殖业细菌感染性疾病的治疗[5]。四环素类抗生素进入畜禽体内后，大部分仍以母体结构形式进入畜禽粪便和养殖废水中。养殖废水处理系统是四环素类抗性基因的重要污染源，但同时也为其集中去除提供了机会[6]。李超[7]调查研究了石河子周边的5家养殖场废水中四环素类抗性基因的丰度，通过分析比较发现tetM、tetO和tetW的最高浓度分别为1.32×106 gene copies/mL、3.03×109 gene copies/mL、2.10×109 gene copies/mL。养殖废水的处理常采用活性污泥工艺，通过好氧、厌氧反应器的交替运行来去除不同类型的污染物，然而好氧、厌氧生境对抗生素抗性基因的去除效果和机制仍不明确。Tao[8]等研究了6座采用不同活性污泥工艺的规模化养猪场养殖废水处理过程中5种抗性基因的消减情况，发现在缺氧条件下，抗性基因的丰度会增加。但马壮[9]通过研究AO4（AnoxicOxicOxicOxicOxic）微氧曝气系统中的ARGs相对丰度的变化，发现低溶氧浓度运行会使可移动遗传元件复制的代谢负荷增加，进而抑制ARGs产生和扩散，从而降低系统中ARGs的相对丰度。
Cu、Zn是畜禽生长所必需的微量元素，因此被广泛添加于畜禽饲料中。但Cu、Zn不能完全被动物吸收，大多以原药的形式随畜禽粪便排出动物体外[10]。雷慧宁[11]调查了浙江省某规模化养猪场废水中重金属的残留情况，发现养猪场的冲栏水中，Cu2+和Zn2+的浓度范围分别为33.29~2463.72 µg/L、133.77~12871.36 µg/L。很多研究证明，环境中的ARGs的丰度与Cu、Zn等重金属的浓度具有显著相关性。Lglesia[12]等研究表明As、Cu等重金属和抗生素的复合污染会增加环境中ARGs的丰度。Ji[13]等通过研究上海多个畜禽养殖场的粪便和周边的土壤样品，发现重金属As的含量与tetB基因的丰度也呈现显著正相关性。与抗生素相比，重金属的化学性质较稳定，在养殖废水处理过程中易于沉积、吸附在活性污泥中，不易降解。养殖废水中Cu2+和Zn2+与抗生素的共存不可避免地会对抗生素抗性基因的去除产生影响，值得关注。
1 材料与方法
1. 1实验设计
首先活化从城市污水处理厂取回的二沉池回流污泥。在500 mL锥形瓶中接入200 mL取回的二沉池回流污泥，每日加入人工废水200 mL，放入摇床（25 ℃，160 rpm）进行污泥的活化培养，培养约7d，污泥颜色由黑色转为土黄色，沉降性能良好时，停止污泥活化，开始进行好氧和厌氧生境实验。
好氧生境下，活性污泥中微生物的呼吸类型以好氧呼吸为主；厌氧生境下，其呼吸类型以无氧呼吸和发酵为主。好氧生境使用500 mL锥形瓶，放入300 mL泥水混合物（150 mL泥+150 mL配置的人工废水），放入摇床培养（25 ℃，160 rpm），厌氧生境使用500 mL蓝盖瓶，放入300 mL泥水混合物（150 mL泥+150 mL配置的人工废水），放入25 ℃恒温培养箱中。在两种氧生境下，分别设置5组处理：空白对照（ck）、100 μg/L四环素（简称“四环素”）、100 μg/L四环素+5 mg/L Cu2+（简称“四环素+ Cu2+”）、100 μg/L四环素+5 mg/L Zn2+（简称“四环素+ Zn2+”）、100 μg/L四环素+5 mg/L Cu2++ 5 mg/L Zn2+（简称“四环素+ Cu2++ Zn2+”），每组设置3个平行处理。四环素抗生素以盐酸四环素溶液添加，配置0.1 g/L盐酸四环素溶液，每瓶加入量为0.3 mL；Cu2+以CuSO45H2O溶液添加，配置5 g/ LCu2+溶液，每瓶加入量为0.3 mL；Zn2+以ZnCl2溶液添加，配置5 g/L Zn2+溶液，每瓶加入量为0.3 mL。前期每7天取样一次，后期每12天进行取样和测定。将泥水混合物静置沉淀后，取活性污泥，测定污泥的氧化还原电位（Eh）和污泥含水率，并提取DNA，选择四环素类抗性基因tetA、tetO、tetW进行PCR扩增，测定基因丰度。取上清液，测定pH、TOC、NH4+N、NO2N。

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