目录
红酵母对Cu(II)的解毒作用：从胞外到胞内 I
摘 要 I
ABSTRACT II
第一章 文献综述 1
1.1 铜污染的危害、来源及防治措施 1
1.2 铜的致毒机制 3
1.3 微生物对重金属的解毒机制 4
1.4 胞外多聚物（EPS）对重金属的吸附作用及机理 5
1.5 微生物细胞膜/壁抗铜机制研究 9
1.6 微生物细胞内抗铜机制研究 12
第二章 材料与方法 15
2.1 实验材料 15
2.1.1 实验菌株 15
2.1.2 培养基的配制 15
2.1.3 实验试剂 15
2.2 实验仪器 15
2.3 实验方法 16
2.3.1 理化性质分析 16
2.3.2 EPS提取及三维荧光测定 16
2.3.3 微生物生理指标测定 18
2.4 数据分析方法 19
第三章 结果与分析 20
3.1铜胁迫下红酵母实验 20
3.1.1 pH和Cu去除效果分析 20
3.1.2 EPS分析 23
3.1.3 细胞壁/膜分析 25
3.1.4 细胞内部生理反应 26
3.2铜和铅共同胁迫下红酵母实验 31
3.2.1 pH和Cu去除效果分析 31
3.2.2 EPS分析 32
3.2.3 细胞壁/膜分析 38
3.2.4 细胞内部生理反应 39
第四章 讨论 41
4.1 铜胁迫对红酵母的影响 41
4.1.1 铜胁迫对红酵母去除效果的影响 41
4.1.2 铜胁迫对红酵母EPS的影响 41
4.1.3 铜胁迫对红酵母细胞膜/壁的影响 42
4.1.4 铜胁迫对红酵母胞内囊泡的影响 43
4.2 铜和铅共同胁迫下对红酵母的影响 44
4.2.1 铜和铅混合体系对红酵母去除效果的影响 44
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/> 4.2.2 铜和铅混合金属对红酵母EPS的影响 44
4.2.3 铜和铅混合体系对红酵母细胞膜/壁的影响 45
4.2.4 铜和铅胁迫对红酵母胞内生理反应的影响 46
4.3 热提法和阳离子交换树脂（CER）法提取EPS的比较 46
第五章 结论与展望 48
参考文献 50
附录：作者在攻读本科学位期间发表的论文 62
致 谢 63
红酵母对Cu(II)的解毒作用：从胞外到胞内
摘 要
铜是动植物必需的微量营养元素，近年来，随着工农业的高速发展，铜污染已成为重要的环境问题，而具有成本低、无二次污染的生物修复法成为当前的研究热点。在红酵母（Rhodotorula mucilaginosa：Rho）具有分泌大量胞外聚合物（EPS）能力的同时，其细胞内部含有丰富的囊泡（Ves）。本研究探讨了Rho从细胞外部的EPS到细胞膜/壁层次再到细胞内部囊泡结构的抗铜毒性机制。Cu2+浓度分别设置为0，50，100，200 mg/L。相较于其他重金属（如Pb2+）而言，低浓度的Cu2+胁迫并没有对EPS产生明显的刺激作用，特别是EPS中谷胱甘肽（GSH）含量没有发生明显变化。当Cu2+浓度从0 mg/L增加至200 mg/L时，Rho对Cu的去除率由35%下降至0%，说明铜离子与EPS的结合能力不高。电化学分析结果表明，EPS在电位值为0.35 V（还原）和0.02 V（氧化）条件下出现氧化还原峰。EPS发生的HaberWeiss反应降低了真菌抵抗铜毒性的能力。细胞外部与细胞内部的铜离子浓度差增大。此外，随着铜对Rho的胁迫增强，细胞膜厚度从450 nm降低至116 nm，这种变化加速了铜离子向细胞内部的转运，但细胞膜与细胞内部的氧化还原反应都在一定程度上受到限制。Cu2+浓度为100 mg/L时，在透射电镜中观察到细胞内囊泡对铜离子存在明显的吸附作用，但浓度达到200 mg/L时，囊泡形态发生变化并逐渐失去活性。
在实际应用过程中，污染环境中通常含有多种对动植物具有毒害性质的金属离子，因此研究多种离子共存情况下酵母菌对金属离子的生物吸附具有实际意义。当Cu2+和Pb2+浓度由0.0003 mmol/L上升至1.2 mmol/L时，Rho对Cu2+的去除率由73%降低至26%，0.9 mmol/L时，去除率达到最低值21%，但从显著性分析结果来看，与1.2 mmol/L时的去除率没有显著区别，说明浓度达到0.9 mmol/L后，Rho对金属离子的去除作用不再发生显著变化。随着两种离子浓度的上升，Rho细胞外部代谢的类蛋白类物质和富里酸呈相对明显的上升趋势。但是在高浓度条件下，由于EPS的分泌受金属胁迫。在细胞外部只能检测到腐殖酸，说明此时Rho仍具有分泌有机酸的能力，以实现重金属的解毒作用。离子浓度的升高也导致细胞膜通透性发生下降，外界铜离子加速进入细胞内部增强毒害作用。当两种离子浓度不高时，Rho细胞能利用胞内蛋白和囊泡的作用抵抗进入细胞内部重金属颗粒的毒性，达到较高浓度后，大量细胞破碎死亡，胞内囊泡的运输能力受阻，蛋白含量下降，但此时仍远超过单铜体系下的细胞内蛋白含量，这说明混合胁迫下红酵母细胞内的解毒机制远比单铜胁迫下的复杂，最后在不同实验条件对EPS提取效果的研究中发现热提法比CER法具有更好的提取效果，且提取条件为70℃加热20分钟时，EPS提取效果最佳。

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