[目的]由于去除胞外多聚物（EPS）对假单胞菌接合效率的影响尚不清楚，本实验拟对此开展研究。[方法]以三株假单胞菌P. stutzeri A1501，P .Putida KT2440和Pseudomonas sp. PH6为受体细菌，通过三亲接合、稀释涂布和抗生素筛选等，探究去除EPS对假单胞菌三亲接合效率的影响。[结果]结果表明，去除EPS后促进了P. stutzeri A1501，P .Putida KT2440和Pseudomonas sp. PH6的接合作用。去除EPS后，A1501的接合效率提升17%；KT2440的接合效率提升116.8%；PH6的接合效率提升5.06%。[结论]去除EPS后，受体菌与供体菌和辅助菌的接触较之未去除EPS有所增强，增加了接合的机会，提高了接合效率。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1菌株、试剂和培养基2
1.2受体菌株的抗性检测2
1.2.1配置抗生素2
1.2.2受体菌株的抗性检测3
1.2.3供体菌和辅助菌的抗性验证3
1.3去除胞外多聚物（EPS）3
1.3.1菌株培养3
1.3.2提取EPS3
1.4上清液成分测定3
1.4.1测定多糖：苯酚硫酸法3
1.4.2测定蛋白：使用试剂盒测定4
1.5去除EPS致死率测定4
1.6三亲接合效率测定4
1.6.1三亲接合4
1.6.2阳性接合子筛选和接合效率计算4
1.7质粒提取及酶切验证5
1.7.1质粒提取5
1.7.2质粒酶切验证5
2 结果与分析5
2.1抗生素抗性结果5
2.2致死率结果6
2.3接合效率6
2.3.1阳性接合子的荧光检测6
2.3.2接合效率7
2.4含有EPS上清液的组分分析7
2.4.1多糖含量7
2.4. *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
2蛋白质含量7
2.4.3组分分析7
2.5质粒验证结果8
3结论8
致谢8
参考文献8
去除胞外多聚物（EPS）对假单胞菌接合效率的影响
引言
引言
假单胞菌属 (Pseudomonas sp.) 属于γ变形菌纲中的假单胞菌科，在自然界中分布广泛。恶臭假单胞菌 (Pseudomonas putida)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginoda)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fLuorescens)和丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)是几种最为常见的常见假单胞菌【1】。基因组工程的发展促使对假单胞菌的基因组测序更加方便完善，预测的次级代谢产物种类比较丰富，将会在微生物研究方面开创较为广泛使用领域。
假单胞菌在生物转化领域具有一定优势。通常情况下低温有助于蛋白质的正确折叠【2】，而假单胞菌中有很大一部分属于耐冷菌，因此可以利用假单胞菌作为宿主生产一些中温菌宿主表达不理想甚至无法表达的蛋白质。同时由于不同种的假单胞菌有多样的营养代谢类型，随之也拥有众多不同的代谢途径，这位生产某些其他菌株难以生产的物质提供了可能。假单胞菌可用于三亲，也可用于转化，其转化类型以假单胞菌参与的环节可大致分为两部分：一、以假单胞菌本身菌体进行生物转化；二、利用假单胞产生的酶参与其他菌种的生物转化。
假单胞菌在环境生物修复领域也有其特点。E.coLi等模式菌株无法在野外大规模使用，其原因是野外环境的温度、pH波动较大对菌株的生长产生了较大影响。而假单胞菌是自然界的土著微生物，尤其在土壤中更为常见。其能适应的生长温度、pH值变化范围较大；同时其营养代谢类型种类多样，选择空间广泛；其本身被研究得也较为透彻【3】因而，假单胞菌具有比较大的优势。另外有研究发现，假单胞菌的质粒上含有一些降解有机污染物质的基因。这些降解性质粒的存在，为降解工程菌的构建提供了一种可能【4】。
假单胞菌在生物防治领域也有不小作用。非致病假单胞菌在对植物的影响上属于根际促生菌，其中已有一部分被应用于抑制病原菌的生长【5】。有国内研究发现，类假单胞菌分泌的某些蛋白质具有杀虫功效，对该类蛋白的研究开发可能制备成新型农药【6】。另外，许煜泉等【7】发现假单胞菌JKD2能分泌铁载体以抑制稻瘟病菌(Piricu Laria orzae)的生长。还有Wang【8】等发现，由假单胞菌Pesudcmonas aeruginosa K187产生的几丁质酶和溶菌酶能抑制36株真菌的生长。
EPS原意为胞外多糖，后随着研究发现，微生物的胞外多聚物中不仅包括多糖，还包括多种蛋白质，少量核酸（包括DNA和RNA），腐殖酸以及脂类化合物。各组分含量中蛋白质和多糖占据有机物总量的70%80%，其余部分仅占10%20%【9】。随着研究的深入，EPS理解由胞外多糖改变为胞外聚合物。微生物通过分泌的EPS形成一个微栖息地【10】，胞外多聚物提供给细菌自我保护的空间，并且能在饥饿环境下为细菌提供碳源和能量【11】，细胞间的交互大多需要通过EPS的调节输送，例如物质交换等。EPS的存在还有利于菌体细胞膜的形成，其主要表现为：在膜形成的初始阶段促进细菌吸附到载体上，为细胞膜的形成提供时间；维持成熟生物膜的结构保护细胞外部小环境；减少不良环境对细胞的破坏，比如增强抗生素抗性，减弱消毒剂影响等。大量研究显示：胞外多聚物的存在对菌体生物膜的形成有其必要性，具体表现为当去除某种胞外多聚物，或抑制调控胞外多聚物合成的基因表达时，生物膜的形成会显著降低【12】。但EPS的存在对于假单胞菌属细菌接受外来遗传物质有何影响至今尚不清楚。
基于此，本课题将尝试去除EPS以观察假单胞菌是否能更好得发生接合作用并接受外源质粒，以使假单胞菌的受用面积更为广泛。
1 材料与方法
1.1菌株、试剂和培养基
菌株：受体菌株P. stutzeri A1501、P .Putida KT2440和Pseudomonas sp. PH6，以及供体菌株（E.coLi HB101，含质粒信息，pBBR32245GFP）和辅助菌株（E.coLi DH5α，含质粒信息，pRK2013）皆为本实验室保存或分离菌株；

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