水稻osnramp5对镉锰转运活性差异的关键氨基酸位点鉴定(附件)
overed, and OsNramp5, which we have studied this time, has also played such a role. Previous relevant experimental studies have found that OsNramp5 is responsible for the transport of manganese and cadmium from solution to rice roots. When the OsNramp5 gene is knocked out, the uptake of cadmium and manganese is significantly reduced; when the key site of OsNramp5 is mutated, OsNramp5 is responsible for cadmium and The absorption function of manganese also changes accordingly. Therefore, our experiment aims to identify the key amino acid sites on OsNramp5 that can distinguish between the cadmium and manganese affinity, and design mutant primers to construct mutation sites to search for mutants that can transport manganese but not transport cadmium.Finally, five amino acid sites of L59V, A395K, F409I, A465V and D533V were selected for mutation. The results showed that only A465V, one of the mutation types, could not only reduce the transport capacity of cadmium, but also did not affect the absorption of manganese.This experiment is of great significance for the construction of new varieties of rice with low accumulation of cadmium without affecting the absorption of manganese.Key words: Manganese; Cadmium; NRAMP family; OsNramp5; Site-directed Mutant1 前言1.1 研究背景水稻是世界范围内最重要的粮食作物之一，超过半数的人口以水稻为主食。近年来，由于工业化的发展，矿业开采、工业废水排放、含重金属农药施用等带来严重的环境污染，尤其是重金属镉、砷的污染。重金属污染一方面影响作物的生长及产量，另一方面会降低粮食的品质，甚至对人体健康造成危害，所以有关稻米镉污染的问题一直受到人们密切关注，培育低镉水稻品种一直是我们为之努力的目标。本课题针对镉（Cd）、锰（Mn）转运蛋白OsNramp5进行定向进化。即通过对OsNramp5进行分子生物学分析，筛选能够对镉和锰吸收具有差异性的关键氨基酸位点。通过构建具有转运锰而降低镉吸收的突变型，以此为依据培育低镉积累的优质水稻，这将对提升水稻的产量和品质有着深远的意义。1.2 水稻中Cd的吸收1.2.1 Cd的来源及分布土壤镉的来源有两种，一种为自然源，一种为人为源。自然源主要来自矿物的成土母质，含量较低，不会影响到作物的生长及人体的健康。而土壤镉的人为活动源来源广泛，主要有三个方面一是大气沉降，工业废气中含有大量的Cd元素，吸附在灰尘上通过大气沉降进入到地表水及土壤中[1]；二是污水灌溉，工厂排出的废水、生活污水等直接或间接用于农田的灌溉，而其中采矿工业、电镀工业、碱性电池工业产生的工业废水及城市居民产生的生活污水中往往含有大量重金属，因此污灌直接导致了土壤重金属污染，是我国农田土壤镉污染的主要原因[2]；三是施肥不当，据估计，全球磷肥中平均含镉量为7mg/kg P，某些地区磷肥中Cd的质量分数甚至可能高达70-150mg/kg P，这些磷肥的施用可能给全球带入约660t的Cd [3]。由于磷肥是由磷矿加工而来的，而磷矿中Cd的含量较高，早期磷肥加工较为简单，重金属含量较高，再加上人们对化肥的不合理使用，使化肥的施用也成为土壤Cd的主要来源[4]。镉在水稻体内的分布通常情况是根＞茎＞叶＞种子，而在种子中颖壳浓度又高于籽粒中的浓度，所以水稻从根吸收的镉只有一部分能通过食物链进入人体[5]。镉的这种分布特点主要是由于水稻本身为了保证种子的正常繁殖，进化出多种抑制镉等有害金属在籽粒积累的调控途径。1.2.2 水稻中Cd的污染现状及危害近些年来，随着工业的快速发展及农业农药化肥的大量使用，我国的土地正面临着越来越严重的污染。根据2014年全国土壤污染状况调查公报显示，我国有16.1%的土壤超标，污染类型主要以无机型为主，占全部超标点位的82.8%，其中镉是污染最严重的重金属[6]。而水稻作为我国的主要粮食作物，由于它比其它作物更容易富集镉，因此水稻的镉污染严重危害植物及人类的健康。镉进入土壤后，由于形态的变化，导致其生物有效性也会发生变化，当到达一定阈值后，就会对水稻产生毒害作用。由于重金属镉大多数集中在根系，因而根系是整个植株中受害最直接也是最严重的器官，其影响大于对芽的影响，主要表现在根的数量减少、根的伸长被抑制[7]。研究表明，当水稻植株组织中含有低浓度的镉时，对生长表现为促进作用，而当镉浓度达到10 mg/kg时，水稻生长受到抑制，具体表现为叶片失绿，出现褐色条纹，严重时会伴随根毛发育不良、根系少短的情况出现[8]。1.2.3 Cd的转运机制镉不是植物生长必须的元素，所以它没有专门的转运蛋白，但由于它与部分必须元素在结构上有一定的相似性，因此能与其他金属转运体结合转运到植物体内。根据国内外研究表明，镉是通过铁、锰、锌等必要元素的吸收途径进入到植物体内的[9]。植物细胞壁呈负电荷，因此土壤中的正价镉离子在细胞壁的作用下富集在根际周围，通过根表皮及外皮层的金属转运通道跨膜转运进入根际细胞内，再经过共质体途径转运至皮层、内皮层及中柱细胞，部分镉也可以通过质外体途径扩散至凯氏带外围，经内皮层离子通道进入到细胞内，再通过共质体途径转移到其它组织[10]。近些年来有关镉转运的机制取得了显著进步。研究发现，拟南芥的AtNramp1、AtNramp3、AtNramp4具有Mn、Fe、Cd的转运活性，2010年，有文献报道了AtNramp1负责拟南芥中镉的吸收。另外两个铁的转运蛋白，OsIRT1和OsIRT2，也被报道参与了水稻中Cd的吸收[11,12]。有研究发现OsNramp1，是一个受缺铁诱导的Cd转运蛋白，该基因在有正常铁含量下表达量很低，但在缺铁的情况下表达量很高[13]。OsHMA3，一种定位在质膜上的转运蛋白，并具有Cd的转运活性，它可以把镉元素固定在水稻根部的液泡中，抑制镉从水稻根部向地上部分的转运，减少水稻地上部分的镉含量，从而降低稻米籽粒镉的积累[14]。2012年， Ma研究认为OsNramp5是镉转运到根部细胞最关键的一步，敲除了OsNramp5基因能有效降低水稻地上部分镉、锰的积累[15]。2018年，又有一个与水稻镉转运有关的基因被报道，即结节表达的转运蛋白OsCCX2，一个假定的阳离子/Ca的交换通道，介导了镉在水稻籽粒中的镉积累。他们的研究发现敲除了OsCCX2会导致水稻籽粒中镉浓度有明显的降低，并且进一步研究显示，这个基因的分布会导致镉从根部向地上部分的转运比率减少[16]。1.3 Mn对植物生长的作用1.3.1 锰的来源及高锰的危害锰作为地壳中含量较为丰富的主要元素之一，广泛存在于各种成土母质中，经过风化作用而释放到土壤中，因此土壤中锰的背景值较高。锰作为植物生长的必须元素，土壤中正常浓度锰并不能对植物造成伤害。但是近些年来，由于矿物的过度开采，工业的高度发展以及农药化肥的过度使用，导致大量的锰元素进入土壤，造成土壤中的锰元素严重超标，严重危害了植物的生长发育和人类的健康。1.3.2 锰的生物学功能锰是大多数生物体必需的微量营养元素，作为酶的辅助因子参与许多生化途径。首先，它作为叶绿体的组成部分，参与了植物的光合作用，是光诱导系统的水氧化反应的催化中心；同时，锰也是植物体内重要的氧化剂，参与植物体内的许多种氧化还原反应；另外，锰还是许多酶促反应如三磷酸循环中的脱酸反应和脱氢反应等的激活因子[17]。因此，对于植物而言，锰缺乏会导致植物产生植株偏黄等症状，长期缺锰还会导致植物更容易受到低温胁迫和病原菌感染，导致作物产量降低[18]。1.3.3 锰在水稻中的转运机制尽管锰作为植物生长必须的营养元素，但长期以来，人们对锰在水稻中的转运机制并没有深入了解，近些年来，才有相关研究者对锰在水稻中的转运机制进行深入研究。2012年，日本Ma JF实验室发现了控制水稻中Mn吸收和地上部高浓度Mn积累的基因OsNramp5，他们通过实验分析验证了基因敲除品系的根和芽中Mn和Cd的含量明显低于野生型水稻[15]。这是水稻中锰吸收的分子机制首次被证实，该研究发现了将锰元素从土壤中摄入根表皮细胞内所需要的转运蛋白，而将细胞内的锰元素通过凯氏带转移到中柱向地上部运输的转运体还未被找到。2015年，该实验室又成功克隆了在水稻进行锰吸收时不可或缺的排出型转运体基因OsMTP9，并通过实验验证了敲除OsMTP9基因能明显降低Mn的吸收和根部向地上部分的转运活性[19]。这二者合作将根表皮细胞吸收的锰转运入皮层细胞，再通过凯氏带转移到中柱向地上部运输。1.4 NRAMP概述NRAMP家族基因在植物中很早就被发现参与金属离子的转运，先前的研究也已经确定了在拟南芥中有6个Nramp基因，而在水稻中有7个Nramp基因，它们分别扮演着不同的角色，在某种程度上又有着一定的相似性。拟南芥中的6个基因，其中AtNramp1定位在细胞质膜，先后发现具有Mn2+、Fe2+、Cd2+的转运活性，负责根部从外界对Mn2+、Fe2+、Cd2+的吸收[20]。AtNramp3和AtNramp4定位在液泡膜，具有Mn2+、Fe2+的转运活性，负责在种子萌发过程中从液泡中输出铁，同时维持着植物成年阶段的锰平衡[21,22]。AtNramp6定位在水泡状内膜，与镉在细胞内的分布和可利用性有关[23]。水稻中有7个Nramp基因，有5个基因的功能已经被克隆，它们都被定位在质膜上并且扮演着不同的功能。2011年，OsNramp1被发现具有Fe2+和Cd2+的转运活性并参与镉的积累，后来又发现具有As (III)的转运活性，但OsNramp1不具有Mn2+的转运活性[13]。OsNramp3定位在茎节的维管组织，在锰的分布上起着重要的作用，但是对Fe2+和Cd2+没有转运活性[24]。OsNrat1（OsNramp4）是水稻中第一个被报道具有三价金属转运活性的NRAMP成员，结果显示其对Al3+具有转运活性，使水稻根部对Al有更高的耐受性[25]。2012年，OsNramp5被发现能够介导Mn2+和Cd2+的吸收，并且参与了水稻中90%的Cd吸收[15]。2017年，OsNramp6被发现具有转运铁和镉的功能并且在高铁供应条件下对水稻防卫基因表现出较强的诱导作用，增强了水稻对稻瘟病菌的抗性[26]。有关OsNramp2和OsNramp7两个基因的功能还尚不明确。1.5 OsNramp5的主要功能论述OsNramp5，该基因位于第7染色体上，具有13个外显子和12个内含子，全长6784bp，其中CDS全长1617bp，编码 539 个氨基酸[27]。近些年来，有关OsNramp5的功能不断的探索出来。2012年，日本的学者首次介绍有关OsNramp5 的功能，他们通过OsNramp5品系的敲除实验及缺素培养实验，确定水稻OsNramp5是一个负责根部锰的吸收的主要转运蛋白，也是导致幼苗锰的高积累的主要因素，同时他们也认为Nramp5是镉从根际进入根部细胞的主要途径[15]。这个研究结果揭示了OsNramp5的两面性，一方面它控制着植物必需元素Mn的吸收，但另一方面它又是有害元素Cd进入植物体内的主要途径。相关研究确定了OsNramp5的表达图谱，OsNramp5在年轻的生育组织中表现出很强的表达信号，如穗、小穗、壳。OsNramp5在胚芽和幼枝，叶和根中也表现出了高水平的表达，水稻抽穗期的茎部也有一定的表达。相反，在成熟叶片、旗叶、叶鞘或胚乳中，很少或没有发现OsNramp5的表达。2014年，Yang 等人发现OsNramp5在中柱细胞尤其是在木质部区域呈现高水平的表达，暗示着OsNramp5可能参与了木质部介导的根部向地上部分的运输。此外，在根的成熟区外皮和内皮中也观察到OsNramp5表达，尽管表达水平低于木质部[28]。OsNramp5在水稻组织中的定位决定着它的主要功能，如木质部的高表达水平可能暗示着它主要负责Cd和Mn从地下部分通过木质部向地上部分的运输。OsNramp5调控着Cd和Mn在水稻中的转运，那么如果通过找到控制Cd转运功能的关键位点并将它进行突变，这为镉低积累水稻新品种的分子选育方法提供了机会。例如利用分子标记辅助选择策略从水稻种质资源中筛选OsLCT1功能缺失的等位基因，从而快速选育产量、健康和营养价值不受影响的低镉水稻新品种[29]。近年来，有关基因突变的技术在不断完善，如定向诱导基因组局部突变技术（TILL-ING），它是一种快速高效的突变筛选技术，可用于从非转基因水稻突变体库中筛选OsLCT1等镉积累基因突变的材料[30]；序列特异性核酸酶（SSN）也已被证明是通过基因特异性编辑从而达到作物改良的有力工具；而近些年来新报道的CRISPR/Cas9被认为是一种最有效的基因编辑方法[31,32]。2015年，一篇关于AtNramp4区分镉突变体的鉴定为我们提供了OsNramp5突变体的鉴定方法。他们通过找到能够影响镉吸收的保守序列并进行定向诱变，最终通过元素分析及统计分析寻找到能限制Cd运输的AtNramp4突变体[33]。这些实验也为我们今后在寻找水稻中限制Cd转运的OsNramp5突变体以及其他相关的实验提供了借鉴意见。2 材料与方法 2.1 实验材料2.1.1 基因材料和来源本实验所用基因OsNramp5是从日本晴cDNA扩增出来的。其相应的突变体是通过设计突变引物应用重叠延伸PCR进行定点突变获取的。2.1.2 菌株和载体大肠杆菌感受态DH5α；酵母菌株SEY6210（野生型，背景为MATα; leu2-3112; ura3-52;his3-Δ200; trp1-Δ901; suc2-Δ9; lys2-801 ）；Δsmf1（Mn吸收缺陷型）；酵母异源表达载体pYES2，来自本实验室。pYES2载体为氨苄青霉素抗性，载体图谱及酶切位点见图一。图一 pYES2载体图谱Figure 1 pYES2 vector map2.1.3 培养基LB培养基NaCl 1%，酵母粉 0.5%，蛋白胨 1%，固体培养基再加2%的琼脂粉，121℃ 20 min高压蒸汽灭菌；YPD培养基1%的酵母粉，1%的蛋白胨 ，2%的葡萄糖，121 ℃ 15 min高压蒸汽灭菌；SD-Ura（葡萄糖）培养基一袋SD/-Ura Broth固体粉末加500 ml水，固体培养基再加2%的琼脂粉，121 ℃ 15 min高压蒸汽灭菌，试剂来源于Takara Bio Company；SD-Ura培养基2% 的D(+)-Galactose，0.67%的YNB，0.077%的SD-Ura，固体培养基再加2%的琼脂糖，另加不同浓度的CdCl2 (终浓度为0、10、20 µM)和不同浓度的EGTA（0 mM、1 mM、2 mM），121 ℃ 15 min高压蒸汽灭菌。2.2 实验方法2.2.1 定点突变方法OsNramp5基因的编码区CDS含有1617bp，编码539个氨基酸。根据蛋白结构比对，我们选定了五个氨基酸位点作为关键位点进行定点突变，包括单氨基酸位点突变和双氨基酸位点突变。OsNramp5基因cDNA核苷酸序列和氨基酸序列见附录A。以单突为例，其具体突变方法是在OsNramp5基因设想的突变位点处设计两条引物，进行重叠延伸PCR设计突变位点引物的软件是Primer 5.0，所用到的引物序列见表一，建立的GXL体系见表二。表一 设计突变位点所用到的引物Table 1 Primers used in the design of mutation sites引物名称Primer name引物序列（5’-3’）Sequence( 5’-3’)L59V-FAGCCTACtgtGATCCTGGCAATTTGGAAACCL59V-RCAGGATCacaGTAGGCTAAAGACACCATGAATCCAA395K-FGCCTCATCATCATCaagTCGATGATACTGTCCTTCGAGCTA395K-RcttGATGATGATGAGGCGGCCGF405I-FCTGCCGattGCTCTCATCCCTCTTCTCAAGTTCF405I-RATGAGAGCaatCGGCAGCTCGAAGGACAGTA465V-FCAAGTACgtcAACGTGCTCGTCGGCGCCA465V-RGCACGTTgacGTACTTGGGGAGGTCGTTGTGG表二 GXL体系Table 2 GXL system体系System体积Volume5×buffer4 µL2.5mM dNTP1.6 µLGXL DNA polymerase0.4 µLF/R1/1 µLOsNramp5 CDS100 ng50%DMSO2 µLddH2OUp to 20 µL反应条件为98℃ 5min，98℃ 15s，58℃ 30s，68℃ 1min/kb，34个循环，68℃ 10min。其中第二轮PCR只需15个循环。2.2.2 酵母表达载体构建对pYES2载体进行HindⅢ和BamHⅠ双酶切线性化，纯化回收后与含载体同源臂的目的基因重组转化至大肠杆菌并进行阳性克隆筛选和测序验证，重组体系见表三。重组体系建立完成后，PCR仪控温37 ℃ 30 min，4 ℃ 5 min后加入到30 µl DH5α大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30 min，42 ℃热击45秒，冰水浴孵育3 min。加入700 µl LB培养基于37 ℃摇床复苏1小时。取100 µl菌液均匀涂布在含氨苄抗生素的LB平板上，37 ℃过夜培养。表三 重组体系Table 3 Reorganization system体系System体积Volume5×CE MultiS Buffer4 µLLinearized Cloning Vector120 ngPCR product40 ngExnase MultiS2 µLddH2OUp to 20 µL2.2.3 酵母转化实验 试剂准备SD-U培养基，PEG Mixture（50% PEG3350 45 ml，1 mol/L LiAc 5 ml，1 mol/L Tris-HCl 500 µL，0.5 mol/L EDTA 100 µL），1 mol/L DTT，需要转化的质粒DNA；转化方法[34]a. 吸取过夜培养的酵母菌株（处于对数期）1ml于1.5 ml离心管中；b. 12000rpm离心1min，去上清，再用无菌水清洗一次；c. 加5 µL（约500ng）质粒DNA，用枪头吸打混匀；d. 加500 µL PEG Mixture，5 µL DTT，涡旋混匀；e. 室温放置15 min，45 ℃热击15min，冰浴15 min；f. 吸取底部沉淀（约100 µL）涂于相应SD-U培养基上，28 ℃-30 ℃暗培养3-5天。2.2.4 酵母生长实验本实验主要是观察OsNramp5基因突变后酵母菌株对镉及锰的吸收变化。所用酵母菌株包括野生型SEY6210和Mn吸收缺陷型Δsmf1；所用载体为pYES2空载体、pYES2-Nramp5阳性对照和pYES2-Nramp5突变体；所用培养基为SD-Ura培养基。操作步骤a. 含pYES2空载体、pYES2-Nramp5阳性对照和pYES2-Nramp5突变体的菌株中分别挑取单克隆，加入SD-Ura液体培养基30℃培养24h左右，测OD600；b. 取500µL的菌液离心富集后，用无菌水清洗两遍；c. 根据OD浓度将菌液依次稀释到0.2、0.02、0.002、0.0002；d. 按一定的顺序，在SD-Ura固体培养基上点板，设置3个平行；e. 30 ℃培养箱倒置培养3-5天后，观察并拍照。2.2.5 酵母生长曲线本实验共设置2组实验，每组3个平行，一组不加镉处理，一组加镉处理使镉终浓度为15µM。具体操作步骤如下a. 含pYES2空载体、pYES2-Nramp5阳性对照和pYES2-Nramp5突变体的菌株中分别挑取单克隆，加入SD-Ura液体培养基30 ℃摇床培养24h左右，测OD600；b. 离心富集菌液，将菌液的OD值调整至10，分别接种至加镉和不加镉处理的50ml SD-U液体培养基中使菌液终浓度为0.01，预培养3个小时；c. 以未接种的SD-Ura液体培养基进行紫外分光光度计的调零，每隔2个小时或4个小时测一次OD600值；d. 以各时间点菌液的吸光值为纵坐标，以培养时间为横坐标，绘制生长曲线。2.2.6 酵母金属元素分析为分析酵母Cd积累，需对酵母中元素的含量进行测定。本实验设置三个平行，具体操作步骤如下[34]a. 将OD值为10的菌液1ml转移到50 ml的SD-U液体培养基中使菌液终浓度为0.2，预培养2小时；b. 加CdCl2溶液至终浓度为5µM，再培养12小时；c. 预冷EDTA（10 µM，pH=5.0），将菌液离心富集；d. 用4度的EDTA清洗两遍，用灭菌水清洗两遍后液氮冷冻，再用冻干机干燥24 h；e. 千分之一天平称量酵母固体粉末并转移至消煮管中，加5 ml的分析纯硝酸微波消煮1h，石墨炉挥干剩余酸，加10 ml 2%的硝酸涡旋转移至15毫升离心管中离心稀释；f. 电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定Cd、Mn含量。2.2.7 数据分析本实验采用SPSS 20.0进行各重复间的显著性分析，采用Excel进行图表的制作，使用DNAMAN软件进行测序结果的比对。3 结果与分析3.1 OsNramp5基因关键位点的点突变构建OsNramp5基因的编码区CDS含有1617bp，我们通过蛋白结构比对选定了五个氨基酸位点作为关键位点进行定点突变，要突变的关键位点见表四。并将突变了的OsNramp5基因引入表达载体pYES2的HindⅢ和BamHⅠ克隆位点，对得到的阳性克隆进行提质粒测序，测序结果显示点突变序列正确。表四 选定的关键氨基酸位点Table 4 Key amino acid sites selected编号Number蛋白序列突变位点Mutation site of protein sequence突变位点数Mutagenesis1L59V12A395K13F405I14A465I15F405I+D533V23.2 OsNramp5突变体的鉴定及表型分析3.2.1 酵母Cd生长实验分析为了观察这五个突变体转运Cd的功能变化，我们将OsNramp5突变基因导入到酵母表达载体pYES2中，与pYES2空载体和pYES2-Nramp5阳性对照一起分别转化至酵母（野生型SEY6210）中进行酵母的生长实验，暗培养3-5天后，菌株的生长状况如图二所示。可以看出a) 在0 µM的Cd条件下不同突变体在酵母中的表达没有明显差异，而在10 µM的Cd条件下不同突变体在酵母中的表达出现了明显差异；b) 阳性对照对镉的耐受能力明显很低，说明含OsNramp5基因的酵母具有较强的吸镉能力， 而L59V相比与阳性对照而言，对镉的耐受能力更低，说明该突变体使酵母的吸镉能力提高，即该类型的OsNramp5突变基因能够增强酵母对镉的转运能力；c) 与阳性对照相比，A395K、F405I、A465V和F405I+D533V这四种突变类型对镉的耐受能力明显高于阳性对照对镉的耐受能力，这说明这四种突变类型的OsNramp5突变体吸镉的能力均有所较低甚至几乎不吸收镉，因此镉对这四种突变体菌株的毒害作用大大降低，也即说明这四种类型的突变体都能降低镉的转运能力。图二 酵母表达的OsNramp5突变体对镉耐受性比较Figuer 2 Comparison of cadmium tolerance of OsNramp5 mutant expressed in yeast3.2.2 酵母Mn生长实验分析为了观察这五种突变体对锰吸收的功能是否有发生变化，我们按同样的方法进行了转化酵母（锰吸收缺陷型酵母Δsmf1），暗培养3-5天后，菌株的生长如图三所示，可以看出a) 在0 mM EGTA的条件下不同突变体在锰吸收缺陷型酵母中的表达也没有明显差异，而在2 mM EGTA的条件下不同突变体在锰吸收缺陷型酵母中的表达出现了明显差异；b) 含pYES2空载体的酵母只有0.2浓度梯度下有稍微的生长，而pYES2-Nramp5阳性对照的生长状况很好，说明含OsNramp5基因的锰吸收缺陷型酵母具备吸收锰的能力而生长状态良好，而不含OsNramp5基因的锰吸收缺陷型酵母基本不具备吸收锰的能力而无法顺利生长；c) 与含pYES2空载体的酵母和阳性对照相比，只有A465V这一种突变体仍具备较强的吸锰能力，其他四种突变类型的吸锰能力均有明显降低甚至几乎丧失，这与我们想要获得的突变类型是反方向而行的，因此这三种突变类型无法进行下一步转基因的实验。图三 酵母表达的OsNramp5突变体转运Mn能力的比较Figure 3 Comparison of transport capacity of Mn in OsNramp5 mutant expressed in yeast 3.2.3 酵母生长曲线分析 为观察含不同突变体酵母在有镉和无镉状态下的生长趋势，我们设置了两组实验，一组不加镉处理，一组加镉处理使镉终浓度为15µM，并测定了60个小时内的酵母生长浓度，最终做出了如图四所示的酵母生长曲线。由图我们可以知道a) 在不加镉处理的条件下，含pYES2空载体和pYES2-Nramp5阳性对照以及各突变体的酵母生长状态无明显差异且生长状况较好；b) 在镉终浓度为15µM的条件下，含pYES2空载体酵母的生长能力明显比含pYES2-Nramp5阳性对照酵母的生长能力要好，这也说明了OsNramp5具有较强的吸镉能力从而使菌株受到了抑制或毒害作用，这与前面酵母Cd生长实验的结果是一致的；c) 与转入pYES2-Nramp5阳性对照的菌株相比，A395K和A465V这两组突变类型的酵母菌株生长能力要比pYES2-Nramp5阳性对照菌株的生长能力好，这也证明了A395K和A465V这两组突变类型的吸镉能力是有所降低的，受到的毒害作用比阳性对照要轻一些，这与前面酵母Cd生长实验的结果也是基本一致的；d） L59V突变类型的菌株生长能力比pYES2-Nramp5阳性对照的菌株生长能力还要差，说明L59V这种突变类型吸镉的能力比突变前还要更强一些，这与前面酵母Cd生长实验的结果也是一致的。图四 酵母生长曲线Figure 4 Yeast growth curve3.2.4 OsNramp5突变体的Cd含量分析为进一步分析酵母的Cd积累，我们仍对含pYES2空载体、pYES2-Nramp5阳性对照和pYES2-Nramp5突变体的菌株进行预培养并加10mM的CdCl2溶液至终浓度为5µM后，再培养12个小时，测定干酵母中的镉含量并做出分析，分析结果如图五。由图可知a）含pYES2空载体和pYES2-Nramp5阳性对照的酵母菌株之间对镉的积累有显著性差异，说明含OsNramp5基因的酵母菌株具有较强的吸镉能力，而不含OsNramp5基因的酵母菌株吸收镉的能力较弱；b）转入pYES2-Nramp5阳性对照的酵母菌株与转入A395K和F405I+D533V突变基因的这两种菌株相比，对镉的积累有显著性差异，即转入A395K和F405I+D533V突变基因的这两种菌株吸收镉的能力明显减弱；c）转入pYES2-Nramp5阳性对照的酵母菌株与转入F405I和A465V突变基因的这两种菌株相比，虽然阳性对照镉积累的含量要略高于F405I和A465V突变基因的这两种菌株，但显著性分析认为它们对镉的积累无显著性差异；d）从酵母镉积累含量的数据来看，基本趋势与前面实验的一致，虽然本次镉积累实验认为F405I和A465V这两种突变类型是对镉的积累是无显著性差异的，而在前面酵母镉的生长实验中却显示A395K、F405I、A465V和F405I+D533V这四种突变类型对镉的耐受能力都高于阳性对照对镉的耐受能力，形成这种差异的可能原因是仅仅较小含量差异的镉积累对酵母菌株会产生较大的毒害作用。图五 OsNramp5突变体的Cd含量差异图Figure 5 Cd content difference diagram of OsNramp5 mutant注不同柱体标不同字母表示差异显著（P<0.05）.Note: The different letters at different columnl represent the significant difference at 95% probability.4 讨论 4.1 影响Cd、Mn吸收的氨基酸关键位点选择天然抗性相关巨噬细胞蛋白（NRAMP）保守序列比对见附录二，参与OsNramp5金属选择性的关键氨基酸序列如下图[33]。该进化树是基于AtNRAMP4的氨基酸序列进行比对的，因此比对是从M62到I91和D397到P417进行的，但在本实验中，我们基于OsNramp5氨基酸序列，比对是从V54到N73和L391到P409进行的。Mathieu Pottier 等(2015)对AtNRAMP4 cDNA进行错配PCR进行任意突变，并通过三轮的诱变和选择从50000个突变体中筛选出了12个能够降低镉敏感性的AtNRAMP4突变株，其中L67,E401, F413和A463这四个突变位点被反复选择[26]。因此我们本次实验是参考了该实验对氨基酸位点的选择，最终我们选定了L59V、A395K、F409I、A465V和D533V五个氨基酸位点进行突变。4.2 OsNramp5的点突变对Cd、Mn吸收的影响我们对选定的五个氨基酸位点进行突变后，通过酵母生长实验进行鉴定。酵母的镉生长实验分析认为A395K、F405I、A465V和F405I+D533V这四种突变类型对镉的吸收能力都有所降低，且A395K和F405I+D533V这两种突变类型对镉的吸收能力是明显降低的，但酵母的锰生长实验分析认为只有A465V这一种突变体仍具备较强的吸锰能力，其他四种突变类型的吸锰能力均有明显降低甚至几乎丧失。因此本次实验我们最终筛选到了一个既能降低OsNramp5对镉的吸收能力又不改变其对锰的吸收能力的突变类型:A465V突变的OsNramp5，待后续转入水稻中进行下一步水稻的表型分析。由以上我们进行的实验可以发现，OsNramp5的点突变是可以改变该转运蛋白对Cd、Mn元素的吸收。在前面的文献研究中，我们已经说明了OsNramp5基因既控制着Mn的吸收同时也是有害元素Cd进入植物体内的主要途径。首先，该基因作为一个主要负责Mn吸收的转运蛋白，对关键位点进行突变是非常容易影响Mn的转运，本实验中设置的五个突变位点其中四个对锰的转运能力都明显降低也正是说明了这一点。同时，它对镉的转运作用也非常明显，如本实验中pYES2-Nramp5阳性对照的菌株因其能够转运有害元素Cd而在有镉的SD-U培养基上吸收大量的镉而受到毒害因而抑制了其生长，而我们在对选定的关键位点进行突变以后，该突变基因对镉的转运能力有了较为明显的改变。4.3 展望OsNramp5作为一个功能研究已经比较清晰的基因，我们开始将它的研究重点转移到它的突变位点上，目前还没有有关OsNramp5突变体转运镉、锰能力的报道，因此我们本次的实验对未来突变体鉴定具有重要的意义。在本次实验中，我们只找到了一个既能降低OsNramp5对镉的吸收能力，又不改变其对锰的吸收能力的突变类型，而这并非是我们最终的目的，在今后的实验中，这个基因还要被转到水稻中进行水稻的表型分析，这就意味着如果这个基因在水稻中没有出现预期的表型，我们前面所做的内容是没有价值的。因此，在后续的相关实验研究中，还应该尝试多种突变位点的结合或寻找其它新的突变位点进行优化，筛选出多个突变类型，这样才能为后续转入水稻实验的成功提供更大的可能性。当然，随着相关研究的进一步深入，越来越多关于水稻镉转运的基因被发现，这就意味着我们可以从更多的基因上入手来降低水稻籽粒中的镉含量，从而减少人类因稻米摄入而吸收的镉含量。研究发现水稻体内吸收和转运镉的主要途径包括1）根部对镉的吸收；2）地下部分到地上部分的转运；3）节的重新分配；4）叶的重新分配[35]。因此水稻中镉含量减少的第一个途径是中断镉从土壤溶液中转运到根部，控制这一过程的主要基因是OsNramp5基因，它是镉转运到根部细胞最基础的一步，也是最重要的一个基因，研究这一基因的突变体从而获得低镉含量的水稻正是我们本实验的任务。第二个途径是中断镉从地下部分到地上部分的转运，这中间主要控制的基因有OsHMA2和OsHMA3，Takahashi等人在2012年的研究中发现将OsHMA2基因进行突变后，产生的水稻种子中，镉含量仅约为野生型的一半[36]，因此在今后的研究中，OsHMA2和OsHMA3也可以是我们降低镉含量的一个突破点。第三个途径是限制镉在叶片中的再分配，叶片中镉向谷粒中再分配的主要参与基因是OsLCT1和OsLCD基因，研究发现OsLCT1敲除以后，水稻谷粒中的镉含量仅为敲除前的一半[37]；而OsLCD功能缺失T－DNA插入突变体与野生型材料相比，叶片中的镉含量没有差别，但突变体稻米的镉含量却下降了约一半[38]，这说明OsLCT1和OsLCD也是培育低镉高产水稻品种的潜在可利用镉积累基因。总之，随着水稻转运镉相关基因的不断发掘，我们培育低镉高产水稻品种的方向也越来越多，本次实验只是未来众多实验中的一个尝试，低镉高产水稻的时代很快就会到来。致谢参考文献[1] 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Journal of Experimental Botany, 2011, 62(15): 5727.附录A OsNramp5 cDNA核苷酸序列、氨基酸序列及拟突变位点OsNramp5 cDNA核苷酸序列OsNramp5 氨基酸序列及拟突变位点附录B 天然抗性相关巨噬细胞蛋白（NRAMP）系统进化树
目录
摘要 1
关键字 1
Abstract 1
Key words 1
1 前言 1
1.1 研究背景 1
1.2 水稻中Cd的吸收 2
1.2.1 Cd的来源及分布 2
1.2.2 水稻中Cd的污染现状及危害 2
1.2.3 Cd的转运机制 2
1.3 Mn对植物生长的作用 3
1.3.1 锰的来源及高锰的危害 3
1.3.2 锰的生物学功能 3
1.3.3 锰在水稻中的转运机制 3
1.4 NRAMP概述 3
1.5 OsNramp5的主要功能论述 4
2 材料与方法 4
2.1 实验材料 4
2.1.1 基因材料和来源 4
2.1.2 菌株和载体 4
2.1.3 培养基 5
2.2 实验方法 5
2.2.1 定点突变方法 5
2.2.2 酵母表达载体构建 6
2.2.4 酵母生长实验 7
2.2.5 酵母生长曲线 7
2.2.6 酵母金属元素分析 7
2.2.7 数据分析 8
3 结果与分析 8
3.1 OsNramp5基因关键位点的点突变构建 8
3.2 OsNramp5突变体的鉴定及表型分析 8
3.2.1 酵母Cd生长实验分析 8
3.2.2 酵母Mn生长实验分析 9
3.2.3 酵母生长曲线分析 10
3.2.4 OsNramp5突变体的Cd含量分析 10
4 讨论 11
4.1 影响Cd、Mn吸收的氨基酸关键位点选择 11
4.2 OsNramp5的点突变对Cd、Mn吸收的影响 11
4.3 展望 12
致谢 12
参考文献 13
附录A OsNramp5 cDNA核苷酸序列、氨基酸序列及拟突变位点 15
附录B 天然抗性相关巨噬细胞蛋白（NRAMP）系统进化树 16
水稻OsNramp5对镉、锰转运活性差异的关键氨基酸位点鉴定
原文链接：http://www.jxszl.com/hxycl/hxyhj/68435.html
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