作为植物根系组成的一部分，侧根对于植物的固着、吸收营养物质起到重要作用。已经知道，植物激素脱落酸（abscisic acid，ABA）可以调控侧根发育。由于NCED1( 9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶，9- cis-epoxycarotenoid dioxygenases)是脱落酸合成过程的关键酶，因此研究番茄NCED1的原核表达对于解析侧根发生的机理具有重要的分子生物学意义。本实验以“白果强丰”(Solanum lycopersicon)品种番茄为实验材料，采用PCR技术得到全长目的基因LeNCED1，并构建该基因的原核表达载体pET28a-LeNCED1；后续实验对含有重组载体的大肠杆菌Rosseta进行诱导表达，并对目的蛋白进行富集纯化。最后得到基因LeNCED1（Gene ID544163）的生物学信息该基因全长共2170 bp，含有开放阅读框为1818 bp，编码蛋白有605个氨基酸；同时获知在0.1 mM IPTG,16 ℃，160 rpm，诱导12 h的条件下目的基因可在大肠杆菌Rosseta中表达出可溶性目的蛋白。上述结果为NCED1基因生物学功能解析提供了分子生物学知识。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 实验材料 3
1.2 主要试剂 3
1.3 主要仪器 4
1.4 方法 4
1.4.1 RNA的提取与cDNA的获得 4
1.4.2 番茄NCED1基因的获取 5
1.4.3 核酸电泳 5
1.4.4 切胶回收与纯化 6
1.4.5 无缝克隆反应及阳性菌种的挑取 6
1.4.6 目的基因的表达 6
1.4.7 蛋白质的提取与纯化 7
1.4.8 SDSPAGE电泳检测 7
2 结果分析8
2.1 DNA检测结果8
2.2 菌液PCR凝胶电泳检测8
2.3 基因测序结果和核酸序列分析8
2.4 SDSPAGE电泳检测结果10
3 讨论10 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 

致谢10
参考文献11
番茄ABA合成关键酶NCED1编码基因的原核表达
引言
植物根系不仅起到固定植株的作用，而且也可以帮助植物吸收养分，它是植物繁荣的基础[1]。根据是否有明显的不定根，可以将植物根系划分为须根系和直根系两大类[1]，其中直根系由侧根和主根两部分构成。侧根（lateral root）是植物一定部分侧向地从内部长出的许多支根，对于植物根系功能的发挥起着不可或缺的作用。侧根的发生首先开始于主根的适当位置，即中柱鞘细胞，细胞经过分裂、分化从而形成侧根原基，而后持续发育，最后突破表皮并形成侧根[2]。Malamy等[3]将侧根的发生分为八个阶段：第一阶段是建成细胞垂周分裂阶段。第二到第四阶段分别是两细胞层侧根原基阶段、三细胞层的侧根原基阶段、四细胞层的侧根原基阶段。内皮层侧根原基阶段为第五阶段，第六阶段是皮层侧根原基阶段，第七阶段是近乎突破表皮的侧根原基阶段，侧根突破表皮伸长阶段是第八阶段。侧根的发生受到多种因素的影响，不仅包括植物自身的状况，而且也有外界的其他因素。
侧根的发生是植物内源激素和环境共同调控的一个发育过程[1]，如脱落酸、细胞分裂素（cytokinin）等调控侧根形成，生长素决定着部分中柱鞘细胞特化并形成新的侧根建成细胞。ABA是一种具有倍半萜结构的植物激素。De Smet等[4]研究发现ABA抑制侧根的生长和发育是通过抑侧根分生组织的活性和侧根的起始来进行的。董寰等[5]发现生长素是侧根生长发育的主要调节物质，而ABA可以通过影响生长素的积累和分布情况从而影响侧根发生和发育。同时，越来越多的研究证实活性氧(ROS)、碳和氮信号、细胞分裂素、生长素、以及盐胁迫间的交叉对话机制等也参与ABA 调控的侧根生长发育，但是目前对各种信号交叉作用调节侧根生长发育的分子机制尚不清楚。Milborrow[6]研究发现：在高等植物中，ABA生物合成一般分为三个阶段：第一阶段是早期反应即小分子磷酸化中间体发生聚合反应，形成中期反应的前体物质 ；第二阶段是中期反应：以非环化的 C40类胡萝卜素八氢番茄红素作为反应物，形成中间产物9顺紫黄质，最后发生裂解反应成黄质醛 ；第三阶段是后期反应阶段：黄质醛作为C15骨架经反应生成ABA 。
NCED1是ABA合成的关键酶。从化学反应角度来看，NCED基因家族所编码的酶NCED1主要作用在ABA合成反应的第二阶段，可特异性的剪切具有顺式环氧结构的类胡萝卜素紫黄质和新黄质 ，从而生成脱落酸合成所需的直接前体物质—黄质醛。而该步反应就是整个ABA合成反应的限速步骤，因而从化学反应角度证实了NCED1是ABA合成过程的关键酶[79]（图1[10]）；同时，在生物学方面也发现NCED1是ABA合成时必不可少的酶。郭栋梁，李玲等[11]获知，NCED1基因的表达促进ABA降低建成细胞周围细胞的生物活性，进而抑制建成细胞的增殖，最终使其发育成侧根发育过程中所需的原基边缘细胞。崔萌萌等[12]研究得知NCED1基因表达在果实转色期出现高峰，此时果实中ABA的含量也是最高，暗示NCED1基因可能与ABA有着密切关系。冷平等[13]发现在干旱贫瘠等逆境下，当ABA含量达到最高值后，ABA合成关键酶NCED1如果能继续高水平表达，ABA含量也可因此维持较高的水平，即ABA含量的保持需要关键酶NCED1的持续表达。综上所述，NCED1是ABA合成的关键酶。
番茄(Solanum lycoperssicon)，又称西红柿，是茄科茄属一年生或几年生草本植物。现在栽培的番茄的先祖是在墨西哥培养栽种醋栗番茄。16世纪传入欧洲，后分别传入亚洲、北美和日本。中国则是目前番茄生产产量最多、种植面积最大的国家，国内的产地主要集中在河南、山东、新疆和河北等地。番茄果实因其独特的风味、丰富的营养和美丽的外观品质而深受人们的喜爱，成为人们餐上常见的食物。本实验以“白果强丰”品种番茄为材料，对其ABA合成关键酶NCED1进行原核水平表达，以期为NCED1基因功能的进一步研究提供分子生物学基础。
图1全反式紫黄质降解机理
Figure 1 Mechanism of total trans violet yellow degradation
1 材料与方法

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