鞘氨醇杆菌(Sphingobium)是一类重要的多环芳烃（PAHs）降解细菌。本实验以菲降解细菌鞘氨醇杆菌RS2为材料，研究了菌株RS2对菲的降解能力，进一步推测并验证了菌株RS2代谢菲的途径，并通过基因组测序和分析技术预测了菌株RS2中的菲降解基因。结果表明，菌株RS2能够以菲为唯一碳源和能源生长，并在实验室条件下高效降解菲，其在30℃、150 r/min摇床培养72 h后对初始浓度为100 mg/L菲的降解率高达99%；在降解过程中检测到菌株RS2代谢菲的中间产物有1-羟基-2-萘甲酸和水杨酸，据此推测菌株RS2可能通过水杨酸途径对菲进行降解；最后，通过基因分析得知菌株RS2的菲降解基因属于nah-like基因簇，也进一步验证了其对菲的代谢途径应该为水杨酸途径。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 前言 1
2 材料与方法 3
2.1 实验菌株 3
2.2 主要药品试剂和培养基 3
2.3 菌株RS2代谢菲的途径 3
2.3.1 菌悬液的制备 3
2.3.2 菲环境下生长曲线的测定 3
2.3.3 菲及其降解产物的浓度测定 3
2.4 菌体的总DNA提取和全基因组测序 4
2.4.1 菌体的总DNA提取 4
2.4.2 16S rRNA基因的PCR扩增 4
2.4.3 菌株的16S rRNA基因序列 4
2.4.4 菌株的全基因组序列测定 5
2.5 降解基因序列的分析确定 5
3 实验结果与讨论 5
3.1 菌株RS2的特性与分类 5
3.2 菌株RS2的降解特性 6
3.2.1 菌株RS2以菲为碳源的生长和降解曲线 6
3.2.2 菲中间代谢产物的测定 7
3.3 菌株RS2降解菲的关键基因 10
3.3.1 菌株RS2的总DNA提取和16S rRNA基因的扩增验证 10
3.3.2 菲降解关键基因的PCR扩增 10
致谢 12
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/> 参考文献 13
菌株RS2的菲代谢途径及降解基因分析
引言
1 前言
多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，简称PAHs），是由两个或两个以上的苯环排列的化合物（仅由碳和氢组成，不含杂原子）[1]。通常情况下，苯环数越多分子量越大的PAHs越难被微生物降解，可长时间存留在环境中。研究证实，多种PAHs具有慢性毒性和“三致效应”，在很多国家， PAHs已被列为优先控制污染物。菲由3个苯环组成，是致癌PAHs中最小的结构单元，其衍生物多存在致癌性，而本身不具有明显的致癌性[2]。
自然环境中PAHs类污染物的消除主要通过微生物降解实现[3]。以菲为例，很多真菌、细菌、藻类以及原生动物都有降解菲的能力，但是当前的研究较多集中在细菌。自20世纪60年代土壤微生物可降解PAHs被发现至今[4]，对PAHs进行生物降解的研究已经进行了40多年。这些研究集中在对PAHs高效降解菌株的筛选，微生物降解PAHs的作用效果以及PAHs微生物降解机理这些方面[5,6]。以菲作为唯一碳源，从长期受到多环芳烃或石油污染影响的土壤中都可以分离筛选出能够降解菲的细菌。到目前为止，已分离出的PAHs降解细菌主要有以下各属的菌株：拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)[7]，拟诺卡氏菌属(Nocardioides)[8]，假单胞菌属(Pseudomonas)[9]，气单胞菌属(Aeromonas)，粪产碱杆菌(Alcaligened faecalis)，微球菌属(Micrococcus)，黄杆菌属(Flavobacterium)，莫拉氏菌属(Moraxella)，弧菌属(Vibrio)，海杆菌属(Marinobacter)，鞘氨醇单胞菌属(Sphingamonas), 分枝杆菌属(Mycobacterium)以及芽孢杆菌属(Bacillus)和硫酸盐还原菌(SRB)等。
菲，作为典型的PAHs污染物，因为苯环数较少，结构简单，分子中的三个苯环都在一个平面上，较易被环境中的微生物降解。细菌代谢菲的途径主要有：①水杨酸代谢途径：菲被羟基化双加氧酶攻击，断裂一个苯环转化为1羟基2萘甲酸，进而再被另一个双加氧酶攻击断开苯环产生水杨酸，再经水杨醛转化为邻苯二酚，邻苯二酚在裂解酶的作用下进一步代谢，最终生成CO2和H2O。②邻苯二甲酸代谢途径：菲首先也被转化为1羟基2萘甲酸，1羟基2萘甲酸加氧开环生成反式2′羟基苯并丙酮酸，在脱氧酶作用下生成邻苯二甲酸，然后进一步氧化开环直至彻底降解为CO2和H2O[10]。③其他途径：除以上2种较为常见的菲降解途径外，细菌中还有其他一些不占主导地位的降解路径。而且一个菌株并不一定仅仅含有一种菲降解途径，它可能同时拥有2条甚至2条以上的菲代谢路径[10]。Moody等[11]在Mycobacterium sp. PYR1中就发现了3条降解菲路径。
随着对PAHs降解基因研究的不断深入和降解基因库的逐渐丰富，人们认为同种PAHs具有相同降解作用但是来源不同的降解基因，可能具有一定的同源性[12]。菲的降解基因若依照同源性关系进行分类，其中有较大部分是经典的nahlike基因，如pah、ndo和dox基因等。研究nah基因簇时，通常将Pseudomonas putida G7的 NAH7质粒和P.putida NCIB 98164的pDTG1质粒作为经典代表。phn基因与经典的nahlike基因没有同源性，并且二者在基因的排列顺序和DNA序列上都不相同，但却有着相同的基因功能。目前，phn基因也是一类较常见的降解基因。根据Laurie和LloydJones（1999）研究，菲降解基因phn来自Burkholderia sp. RP007，该菌能够以菲为唯一的碳源和能源生长，并且也能降解其它的小分子PAHs，如萘和蒽[13]。phn基因并非目前已知的最优降解基因型，但是在自然环境中，phn基因数量大于nah基因数。Coyal和Zylstra（1996）分离出了3株降解菲的phd基因，其基因顺序为phdAbAaBAcAdDE，其中phdAb基因编码铁氧化还原蛋白，phdAa基因编码铁氧化还原蛋白还原酶，phdB基因编码顺式二羟基脱氢酶，phdAc基因编码铁硫蛋白(ISP)的大亚基，phdAd基因编码ISP小亚基，phdD基因编码异构酶，phdE基因编码水合酶醛缩酶[14]。除了以上这些基因外，环境中还有一些其他类型的降解基因簇，如nid和nag基因[15]。

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