蜈蚣草是一种重金属砷的超积累植物，其地上部砷含量可达植物干重的2%。在自然环境中，五价砷 （As V）是土壤中砷的主要存在形式，同时也是蜈蚣草所吸收砷的主要来源。砷酸盐的化学结构与磷酸盐相似，蜈蚣草极有可能通过磷酸盐转运蛋白吸收土壤中的五价砷。在此，我们从蜈蚣草转录组数据库中分析整理了6个磷酸盐转运蛋白基因PvPht1;1-6，并对其进行了生物信息学分析和表达模式鉴定，结果表明PvPht1;3和PvPht1; 6转录水平受As V诱导，在20μM As V处理条件下，表达量较野生型分别上调80、5倍。利用过量表达烟草材料，我们研究了PvPht1;3对As V吸收转运的影响。过量表达PvPht1;3的烟草株系中，地上部总砷含量较野生型提高了2-4倍，根系向地上部砷转运系数达到野生型的2-5倍。PvPht1;3的过量表达增强了植株对砷的吸收和从根系向地上部的转运。因此， PvPht1;3可能参与了蜈蚣草对砷的高效吸收转运过程。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法 3
1.1 生物信息学分析 3
1.1.1 蜈蚣草、水稻、拟南芥磷酸盐转运蛋白家族成员核苷酸序列的获得 3
1.1.2 PvPht1家族基因多序列比对、进化树构建及蛋白结构域分析3
1.2 表达模式分析3
1.2.1试验材料3
1.2.2植物生长条件及采样3
1.2.3 植物总RNA提取、cDNA合成及RTPCR反应4
1.3 过量表达PvPht1；3对烟草砷积累的影响 4
1.3.1 试验材料 4
1.3.2 转基因苗的鉴定 4
1.3.3 植物生长条件及采样 4
1.3.4 植物总砷含量测定 4
2结果与分析 4
2.1蜈蚣草中高亲和磷转运蛋白基因PvPht1的生物信息学分析 4
2.1.1 序列一致性分析及进化树构建 4
2.1.2 氨基酸队列分析及蛋白功能结构域分析 6
2.2 PvPht1 家族成员表达水平对砷胁迫的响应7 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: *351916072* 

2.3 PvPht1；3过量表达对转基因烟草材料砷吸收转运的影响8
2.3.1 PvPht1；3 过量表达转基因烟草材料的筛选及鉴定 8
2.3.2 PvPT3 过量表达对烟草转基因材料砷吸收转运的影响 8
3 讨论 9
致谢 10
参考文献 11
蜈蚣草磷酸盐转运蛋白的生物信息学分析与表达模式鉴定及PvPT3功能初步研究
引言
砷（Arsenic, As）在自然界中广泛存在，是一种植物非必须的有毒重金属元素。环境中的砷存在多种不同的形态，砷酸盐（Arsenate, AsV）和亚砷酸盐（Arsenite, AsIII）作为其无机态在全球分布最为广泛：As III是厌氧环境中砷的主要形态，主要分布于深层或淹水的土壤环境中；As V是富养环境中砷的主要形态，主要分布于大量着生植物和农作物的土壤表层[1]。因此在大部分地区，As V常作为生物可利用态被植物吸收并进入食物链中，不但严重影响着农作物的品质和产量，还有可能对人体健康产生严重的威胁[2]。
近几十年来，南亚和东南亚已经有很多居民因误食砷污染的水体而产生砷中毒症状[3]。我国是世界上砷污染最严重的国家之一，群体性砷中毒及砷污染的时间时有发生，如何修复砷污染的土壤是全球共同面临的重大环境问题。近年来兴起的植物修复技术利用超富集植物吸收并积累土壤环境中的污染物从而降低污染物在土壤中的浓度以减轻对植物的毒害，该技术因具有成本低、操作简单、对环境扰动较小和无二次污染等优点展现出在土壤修复方面的优势和发展前景[45]。
世界上第一个被证明具有砷超富集能力的植物——蜈蚣草（Pterisvittata）的发现[6]对利用植物修复砷污染土壤具有十分重要的意义。与大多数能够限制或减缓砷积累、易位的砷抗性植物相比，砷超级累植物并不是通过抑制As的吸收而是通过提高其砷耐性从自然环境中大量吸收并富集砷。研究表明：蜈蚣草在砷浓度高达1500ppm的土地上仍可正常生长，其地上部分富集砷的浓度高达22630mg/kg（干重的2%），是土壤中砷浓度的10倍以上[6]。蜈蚣草属蕨类植物门、凤尾蕨科凤尾蕨属，喜爱喜碱性土壤环境，具有较强的适应能力，生长迅速，生物量较大，在我国南方一些适宜的环境条件下，蜈蚣草地上部羽叶甚至可以长达12米。因此，蜈蚣草是一种修复土壤砷污染的理想植物，同时蜈蚣草的砷吸收代谢及解毒机制也有非常重要的研究价值[6]。
了解植物对砷的吸收机制，对阻控砷在食物链中传递有重要意义。砷对植物而言，是影响植物生长发育的有害元素。As(V)能够抑制植物体内ATP的形成，取代DNA磷酸基团中的磷，进而影响植物体内与ATP相关的一系列生理代谢过程；As(III)主要通过与巯基进行螯合，降低植物体内抗氧化物质还原性谷胱甘肽的含量，妨碍植物的生长。在高浓度砷的污染土壤中，拟南芥等非超级累植物受到毒害的症状表现为叶片失绿，根系发育迟缓，植株矮小等[79]。
在好气土壤中，土壤中的无机砷主要以As(V)形态存在[10]。因为相同的化学电位和相似的理化性质，As(V)可以通过高亲和磷酸盐转运蛋白被植物吸收[1114]。由于As(V)与P(V)对植物根系的质膜转运子结合位点存在竞争，因此在植物根系吸收运输时，As(V)与P(V)会产生拮抗竞争。很多生理学试验表明，增加磷的浓度能显著抑制五价砷的吸收，而增加砷的浓度也能显著抑制磷的吸收[1519]。水稻中，当水稻磷酸盐转运蛋白发生突变时，突变体对As(V)的吸收受到限制[20]。拟南芥中，pht1;1pht1;4双突变材料对砷的抗性较野生型有显著提高[2021]。在砷超积累植物蜈蚣草中也存在其它磷酸盐转运蛋白, 它们能够转运As(V)且转运能力比非超积累植物中的转运蛋白更强[15,17]。
为进一步研究蜈蚣草体内砷的抗性和富集机制，为土壤重金属污染的植物分子修复提供备选基因，一些蜈蚣草中参与砷富集的关键基因被克隆获得。近年来，许多关键基因在蜈蚣草砷吸收、转运及代谢过程中的功能研究，取得了丰富的进展。近期，可能参与蜈蚣草As(V)吸收的磷转蛋白PvPht1;3被克隆得到，DiTusa等人在磷缺陷型酿酒酵母突变体和烟草叶片中过量表达了在蜈蚣草中发现的三个磷酸盐转运蛋白基因PvPht1;1 PvPht1;3，其中PvPht1;1和PvPht1;2序列高度一致，PvPht1;1 PvPht1;3均定位于细胞膜上。半定量RTPCR检测显示，PvPht1;3与砷酸盐之间的关系十分密切，过量表达PvPht1;3基因的酵母突变体在砷胁迫的条件下， PvPht1;3的表达量得到显著上调。该实验表明PvPht1;3基因受缺磷和加砷环境的诱导，并能编码一种对砷酸盐具有高亲和性的磷酸盐转运蛋白，而PvPht1;1/2 表达仅与环境中磷水平相关，不受砷胁迫调控，PvPht1;3很有可能是蜈蚣草超富集砷的重要原因之一[22]。

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