研究表明，微生物在体内合成IAA的方式是通过多种途径完成的，而基因ysnE又在解淀粉芽孢杆菌SQR9生物合成IAA的途径中发挥着十分重要的作用。本实验主要是通过HPLC和LC-MS对解淀粉芽孢杆菌SQR9和突变体ΔysnE发酵液中与IAA合成相关的差异性物质进行分析，找到基因ysnE在解淀粉芽孢杆菌SQR9合成IAA途径中的重要代谢物质，以此希望能够对后续的实验产生指导意义。通过对解淀粉芽孢杆菌SQR9和突变体ΔysnE发酵液的HPLC分析，发现解淀粉芽孢杆菌SQR9和ΔysnE发酵液中都含有吲哚乙醇，说明发酵液中有吲哚乙醛的存在，这也进一步说明了SQR9生物合成IAA的途径可能就是吲哚丙酮酸途径、色胺途径和色氨酸侧链代谢途径中的一种或多种。HPLC和LC-MS分析出来的结果，可能是因为基因ysnE的敲除，导致了基因ysnE上游吲哚丙酮酸积累，下游吲哚乙醛消耗，这也说明了基因ysnE很可能参与SQR9生物合成IAA的吲哚丙酮酸途径。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法5
1.1材料 5
1.1.1 供试菌株 5
1.1.2 改良Landy培养基 5
1.1.3 试剂 5
1.1.4 仪器设备 5
1.2方法 5
1.2.1发酵液制备 5
1.2.2发酵液样品处理6
1.2.3薄层色谱法（TLC）检测发酵液6
1.2.4 HPLC分析发酵液6
1.2.5液相色谱质谱联用（LCMS）分析发酵液6
2结果与分析6
2.1解淀粉芽孢杆菌SQR9和突变体ΔysnE不同时间段的发酵液TLC和HPLC分析6
2.2解淀粉芽孢杆菌SQR9和突变体ΔysnE培养96 h发酵液的HPLC分析7
2.3解淀粉芽孢杆菌SQR9和突变体ΔysnE培养96 h发酵液的LCMS分析 8
3讨论 9
致谢10
参考文献10
解淀粉芽孢杆菌SQR9和突变体ΔysnE生物合成IAA相关的中间差异性 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
物质分析
引言
解淀粉芽孢杆菌SQR9是从黄瓜根际中分离的一种促生菌株，其对黄瓜专化型病菌尖孢镰刀菌有着很强的拮抗作用，经过实验研究，其在盆栽以及大田实验中表现的促生与土传病害的防控效果相当显著，而且与腐熟堆肥制成的微生物有机肥料在农业生产中有着非常广泛的应用，研究解淀粉芽孢杆菌SQR9和突变体ΔysnE生物合成IAA相关的中间差异性物质分析能检测解淀粉芽孢杆菌SQR9的促生因子，探索其吲哚乙酸的合成机制，及吲哚乙酸对SQR9的促生影响，对其在农业生产中的高效利用是有着重要意义的，并且SQR9的液体、固体发酵还能够生产研制出复合型生物有机无机复合微生物肥，且可以做为生防菌，对植物促生和土传病害防控有着非常好的效果，所以研究其ysnE突变体吲哚乙酸的中间产物能够对其吲哚乙酸的合成机制及吲哚乙酸对解淀粉芽孢杆菌SQR9的促生影响有更深层次的探索,在生物防护和生物肥料高效化方面有着很好的应用前景。
微生物能够生物合成IAA，各种不同的细菌也能够产生IAA，但这些细菌中有的是植物的益生菌，而有的是致病菌[1]。许多研究表明根际定殖的有益芽孢杆菌能够促进植物生长[2,3,4]，产生的IAA能够刺激植物根毛的生长，并且增加次生根与初生根的数量以及长度，但这是建立在IAA浓度合适的情况而言，浓度过高会产生相反的效果。而解淀粉芽孢杆菌PGPR(plantgrowthpromoting rhizobacteria)菌群（益生菌群）能够生产很多抑制真菌和细菌生长的代谢产物，产生的抗菌蛋白、抗生素、酶以及多肽有能够促进植株生长，拥有生物除污、生防以及植物促生等一系列特征，所以其在农业生产中的作用越来越被重视，它能通过多种机制与植物进行互作，而且作为生物肥料能够有效促进植株的生长，从而提高植物的品质，同时防止植物病害，有效降低植物染病率等，在农业生产中拥有巨大的应用潜力。然而，关于芽孢杆菌PGPR菌群（益生菌群）的促生作用的基本分子机制却知之甚少，这很有可能是多种因素导致的结果[2]。革兰氏阳性菌能够在逆境产生孢子，可以在土壤中不同环境长时间存活，还能够产生多种促生物质，因此被广泛用于农业生产中。许多植物有益细菌能够产生植物激素如吲哚乙酸（IAA），促进植物生长[5,6]。根据研究，微生物合成IAA的途径有多种，其与植物的合成途径也有着相当高的相似度[7,8]，而解淀粉芽孢杆菌SQR9合成IAA主要是以色氨酸为前提的，具体合成途径见图1。最近有关于革兰氏阳性病原菌Rhodococcus fascians合成IAA的报道，然而，关于由生活在土壤中革兰氏阳性菌生产IAA的报道仍然很少[9]。在解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliqueficiens）FZB42中，存在色氨酸依赖型IAN途径和一个色氨酸酰基转移酶ysnE参与的未知途径参与IAA的合成，并且这个ysnE参与的未知途径为FZB42合成IAA的主要途径[10]。解淀粉芽孢杆菌SQR9中存在多种IAA合成途径，包括色胺（TAM）途径、吲哚丙酮酸（IPyA）途径、吲哚乙腈（IAN）途径和吲哚乙酰胺（IAM）途径、色氨酸侧链氧化酶（TSO）途径，以及ysnE参与的未知途径[11]。推测ysnE基因是解淀粉芽孢杆菌中合成IAA的关键基因，其参与的合成途径是解淀粉芽孢杆菌IAA合成的重要途径。前期工作已获得IAA合成突变体ΔysnE，IAA合成路径受阻会导致相应合成中间产物吲哚类物质的积累或减少。其中已知吲哚丙酮酸（IPyA）途径作为植物体合成IAA的主要途径，已经在很多细菌中被发现其中的限速关键基因ipdC催化吲哚丙酮酸转化为吲哚乙醛，该基因在A. brasilense、En. cloacae, P. putida和Pa. agglomerans等多种细菌中被鉴定到[8]，而研究表明IPyA途径失活会导致IAA合成降低，所以此途径对微生物合成IAA十分重要[12]；色胺(TAM)途径中的色氨酸脱羧酶和胺氧化酶在微生物中也被鉴定到[13]；吲哚乙酰胺(IAM)途径是在微生物中研究最清楚的途径，基因iaaM 和iaaH已经在革兰氏阴性菌中鉴定到[14]；吲哚乙腈(IAN)途径现在研究的非常少，腈水解酶目前只在Alcaligenes faecalis鉴定到,研究表明IAN途径经过IAM途径转化为IAA[15]。
在添加了3mM色氨酸处理的时候，突变体ΔysnE的IAA产量只有野生型SQR9的33.6%，这说明ysnE可能是解淀粉芽孢杆菌SQR9合成IAA途径中的关键酶。而本实验正是运用HPLC和LCMS分析方法对解淀粉芽孢杆菌SQR9和突变体ΔysnE发酵液中与IAA合成相关的中间差异性物质做出分析，以此来找到基因ysnE在解淀粉芽孢杆菌SQR9生物合成合成IAA途径中的重要代谢物质。

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