由土传青枯菌Ralstonia solanacearum侵染番茄引起的番茄青枯病是番茄主要病害之一，由于其病原菌在环境中适应突变能力强，一直都缺乏有效的防治手段，化学防治虽然有一定效果，但随着青枯菌抗药性、耐药性的提高，大田防效越来越差，而且化学药剂的使用会对大田的的环境造成破坏，改变土壤微生物群落的种群多样性，且农药残留对人类健康也带来很大的危害。本研究从生物防治的角度出发，在江苏、浙江、湖南、江西等四个省份采取的青枯病健康发病的番茄根际土样，分离纯化出四株抵抗番茄青枯病的专性噬菌体，研究其生物学特性，从而为噬菌体防控青枯病提供有效的理论依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1供试材料 2
1.2实验方法 3
1.2.1强致病力青枯菌活性鉴定3
1.2.2青枯菌专性噬菌体的分离纯化3
1.2.3噬菌体鉴定与生物学特性研究3
1.3数据处理5
2结果与分析5
2.1噬菌体分离纯化结果5 2.2噬菌体生物学特性测定结果 5
3讨论7
参考文献8
图1供试病原菌2
图2青枯菌专性噬菌体筛选的示意图3
图3青枯菌专性噬菌体平板照片5
图4一步生长曲线6
图 5噬菌体对温度的耐受能力7
图 6噬菌体对pH的耐受能力 7
表1不同噬菌体的效价5
表 2最佳感染复数5
青枯菌专性噬菌体的分离纯化以及生物学特性研究
引言
引言 早在1896年，英国的微生物学家Ernest Hankin就发现了噬菌体的身影，他在印度河水中发现了一种具有强灭菌活性的物质，它可以通过磁质滤器，被热水煮沸后灭菌活性则丧失，但遗憾的是Ernest Hankin没有进行更近一步的研究；1898年，类似的现象也出现在了俄罗斯细菌学家Gamaleya的研究中[1]；到了1915年，英国微生物学家Frederick Tw *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
ort首次观察到了金黄色葡萄球菌平板上的透明斑，并进一步提出了病毒感染的假说[2]；1917年，法裔加拿大微生物学家 Félix d’Herelle在研究志贺痢疾杆菌时也发现了噬菌体的的存在，并正式将其命名为噬菌体[3]，并在进一步的实验后证实其可以有效的治疗细菌性感染[4]。至此，噬菌体研究开始了一个阶段的迅速发展。
20世纪国内的生物防治资源大部分局限在细菌、真菌、放线菌上，对噬菌体的研究相对空白。进入21世纪以来，随着细菌对抗生素耐药性的增强, 如今利用噬菌体进行细菌病害防治越来越受到人们的重视。与抗生素相比，噬菌体因其特异性强、副作用少、增殖能力强且不易产生抗性等优点在医学和食品上已较为广泛应用。
在作物中，利用噬菌体进行细菌性病害防治近年来也逐渐被人们重视及开发。20世纪初日本学者分离得到噬菌体P4282和PK101，用于控制青枯病[5]；Tanaka等用含噬菌体的无毒青枯菌株M4S对烟草进行预处理，可有效降低青枯病的发病程度。但这些噬菌体的寄主范围狭窄，只能侵染一部分青枯菌。青枯菌容易变异，种内具有复杂的遗传多样性，只要细菌受体在噬菌体细菌结合所需位点发生一个单一变化就能使细菌对噬菌体产生抵抗力，从而丧失疗效[6]。Bhunchoth等利用从清迈分离到的几株噬菌体用于防控青枯病，发现短尾病毒J 2和RSB 2组合能有效裂解污染的土壤中的青枯菌[7]。有研究表明同时施用噬菌体混合体系在短期内效果更好，而顺次施用策略在长期过程中具有潜在的优势[8]。
综上所述，国内外对于噬菌体防控青枯病的研究大多数局限于一种噬菌体防控青枯病的研究。本试验中我们从不同地区番茄青枯病发病田块分离筛选出四株噬菌体，并研究其生物学特性，为利用噬菌体防控青枯病提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试土样：
从江苏、浙江、湖南、江西、广西等地青枯病发病区域采集得到番茄植株根际土壤样品。
1.1.2 供试菌株：
强致病力青枯菌QLRs1115，本实验室保存。
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图1 供试病原菌
Fig. 1 Strains used in the experiment
1.1.3 主要试剂
NA液体培养基：葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、牛肉膏3 g、酵母粉0.5 g，加入超纯水1000 ml，溶解后于115 ℃高压灭菌30 min
NA半固体培养基：NA液体培养基中加入1.0%的琼脂粉
NA固体培养基：NA液体培养基中加入2.0%的琼脂粉
青枯菌选择性培养基（MSMSA）:NA固体培养基冷却至50℃左右，依次加入过滤除菌的1%的氯霉素5 mg、1%的青霉素5 mg、1%的结晶紫5 mg、1%的杆菌肽25 mg、1%的多粘菌素50 mg、1%的放线菌酮50 mg、1%的TTC 50 mg; 抗生素均购自北京鼎国生物技术有限公司。
SM 悬浮液：取 Mg SO47H2O 2.0 g，Na Cl 5.8 g，1 mol/L TrisHCl(p H7.5) 50 mL，2%明胶 5 mL，加去离子水，定容至1000 mL，分装后于 121℃高压灭菌 20 min，4℃保存，SM 悬浮液用于噬菌体的稀释及保存。
1.1.4 主要仪器
恒温培养箱、摇床、离心机、超纯水仪、超净工作台、恒温水浴锅等
1.2 试验方法
1.2.1强致病力青枯菌QLRs1115
将QLRs1115反复划线培养纯化过后在SMSA固体培养基上划线，观察菌落颜色，确定其致病性的高低。挑取致病性高的单菌落接种于 50 mL NA 液体培养基中，于30 ℃条件下，170 r/min振荡培养 12 h 备用。
1.2.2青枯菌专性噬菌体的分离纯化
将从江苏、浙江、江西、广西等地青枯病发病区域采集番茄植株根际样品。采集的土样按每90 mL SM悬浮液加10 g土样的比例加入三角瓶中振荡过夜，取出后静置。将土壤悬浮液经0.22 µm滤膜过滤后取5 ml 加入对数期的R. solanacearum 菌液中振荡培养12 h，将共培养液用0.22 µm滤膜过滤后即为噬菌体原液。取0.5 ml对数生长期的R. solanacearum菌液与6 ml冷却至50℃左右的NA半固体培养基混匀，立即倒入已凝固的NA固体培养基平板上制成双层平板，待上层培养基凝固后将平板分区，分别点接2 µl 的梯度稀释的噬菌体原液（101，102，103，104，105，106，107，108），28℃倒置培养24 h~48 h，观察有无噬菌斑。当有噬菌斑出现后，挑取单个最大的噬菌斑接入对数生长期的R. solanacearum菌液中，摇匀并静置15 min后放入摇床，在28℃条件下，120 r/min振荡培养12 h使噬菌体增殖，增殖培养后将共培养液用0.22 µm 滤膜过滤，通过上述双层琼脂培养法得到噬菌斑。重复3~5次即可得到较纯的噬菌体。

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