控制环境的pH值对于一个生态系统的健康至关重要，这一指标会影响到系统内生物体的代谢活力，生长与发育。虽然从荧光染色到纳米传感，能够轻易获得pH值的技术范围很广，但这些技术并不能够反映检测开始前的环境pH值，即无法回溯环境pH值的历史大小，而了解环境pH值的历史大小对于了解一个生态系统内所发生的变化至关重要。因此，我们的长期目标就是发展一种能够反映这一指标的技术。在本次实验中，我们提出通过测量一种常见真菌的力学特性来监测环境pH值随时间的变化。我们选取了黑曲霉作为实验对象，通过计算黑曲霉孢子和菌丝的有效压痕模量来评估环境pH对其的影响，此步骤为获得环境pH历史值的第一步。在文章中我们指出，这种解磷菌即黑曲霉的压痕模量与环境的酸碱度有相关性，压痕模量通过原子力显微镜和纳米压痕获得。我们观察到在酸性环境中随着孵化过程模量有显著地单调增长，而在中性环境中模量随着孵化的进行并无显著变化。本实验结果提供了一种思路，即通过使用我们的方法来检测和追踪环境pH值，更进一步的，将微生物的力学特性作为一种环境监测的生物标记方法。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料准备 2
1.2 AFM检测 2
1.3有效模量估算 3
1.3数据分析 3
2 结果与分析4
3 讨论 5
致谢5
参考文献5
研究随时间变化环境pH对黑曲霉力学特性的影响
引言
引言 环境pH值能在很多方面对细胞和组织构成影响，包括细胞代谢，生长，发育等[14]。在生态系统修复方面，环境条件的改变起到决定性的因素，其中就包括了环境pH 值在内的各种环境理化性质。因此，了解环境背景的pH值对于生态系统的修复有重要参考价值。但是环境背景的pH值往往难以获得。前人采用诸如核磁共振成像[5]、荧光染色[6,7]、以及基于粒子的纳米传感器[8,9]等方法能够测出当时的pH，但不能够回溯环境历史的pH。因此，寻找一种能够测量并追踪环境历史pH值的方法是十分必要的。
环境pH值对细胞的影响是多方面的 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
，在此我们选取了通过原子力显微镜（Atomic force microscopy, AFM）对细胞的观察来验证，是否pH变化引起的生物学变化会影响真菌的压痕模量。我们预期的是pH值变化会影响微生物的表面结构，这种变化对于具有细胞壁的生物来说更明显，同时这种表面结构的变化会进一步影响AFM测出的表面硬度。最早被发明出的类似于AFM的设备就是用于测量细胞的力学特性[10]。尽管用AFM无法得到除非在理想状态下的结构化材料的力学模型[11],但是却能够得到关于细胞非常有用的信息[1214]。在微生物学领域，AFM被用来研究苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt.）孢子的粘滞度[15]；有关于大肠杆菌（Escherichia coli, E.coli）的研究表明，大肠杆菌在被丝状噬菌体M13 感染后硬度降低[16]。再将大肠杆菌暴露在氨苄青霉素(ampicillin)下也观察到了与表面修饰有关的硬度变化[17].本课题使用AFM和纳米压痕技术来测量微生物的力学特性，以此来揭示环境pH值与受到影响的力学特性之间随时间变化的联系。
解磷菌（Phosphorus solubilizing fungi, PSF）是一类常见的微生物。这类微生物对酸性环境的适应很强，在pH 12的培养皿中依然能够存活[18]。因为酸度是评价解磷菌活性的关键因素，所以环境pH值与解磷菌之间存在关联的可能很大。
在本课题中我们使用黑曲霉（Aspergillus niger, A.niger）作为实验材料。相比于其他解磷菌，黑曲霉分泌有机酸的能力更强，因此也更适合用作实验材料来揭示AFM纳米压痕与真菌力学特性间随时间变化的联系。本次实验主要检测了黑曲霉的孢子和菌丝的力学特性，这也是首次对黑曲霉在不同环境pH值下力学特性随时间变化的研究。我们的目标是开发该方法的潜力，使力学特性可作为生物标记揭示环境pH的历史值。该方法不仅提供了一种非化学手段测量微生物所处环境pH值的思路，同时对于需要长期监控环境pH值的污染管控[19]有重要的指导意义[20,21]。
1 材料与方法
材料准备
菌株：黑曲霉菌株（NJDL12）
培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（Potato dextrose agar, PDA）被用来培养菌种，其成分为马铃薯（200g/L），葡萄糖（20g/L），琼脂（20g/L）和水（1L）。液态的PDA不加入琼脂。1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH 被用来调节溶液的pH值。
A组：黑曲霉菌株被培养于初始pH 1.5的酸性培养基中。
B组：黑曲霉菌株被培养于初始pH 6.5的中性培养基中。
两组在不同pH值下培养的黑曲霉菌株所产生的孢子在环境温度28℃下被放入摇床中振荡摇匀（转速为170 r/min）.取培养基中的液体一滴置于硅片上自然风干，用以进行AFM的检测。同时为了保证时间因素的影响，要对孵化后第3、5、7天的黑曲霉的菌丝和孢子都进行了检测。
以上所有样品的准备工作都在超净台上进行。
AFM检测
设备：原子力显微镜 （型号：AFM Dimension Icon, 布鲁克公司）
为了检测样品的弹性系数，探针采用带有锥尖的铝反射涂层硅悬臂探针（型号Tap 150AlG），半锥尖的角度为10°，半径为10 nm,震动频率为150 kHz，公称力常数为5 N/m ，探针的实际弹力常数在每次检测前都会进行校正。实验中使用轻敲模式来测量力位移曲线。所有样品的压痕深度在100至300 nm 之间。
黑曲霉的孢子和菌丝在AFM下被成像和探测。每一个压痕的位置都在50×50μm 的视野范围内。为了避免边缘效应和针尖滑动的影响，需要将圆形的孢子样本置于视野中央，长形的菌丝置于中线上。为了能比较样本间和样本内的差异，每一个样本上都要选取五个点进行检测，每个点接触三次。
进行压痕的过程分为两个部分：针尖靠近（approach）和针尖回缩（retract）过程。针尖靠近过程持续到探针接触到样品且探针的悬臂产生弯曲形变。针尖回缩过程值针尖逐渐远离样品的过程。（如图1） 除进行纳米压痕得到力曲线之外，还对在不同环境条件下生长的样品的表面结构进行了探测。
有效模量估算
用压痕法测量非均质的，形状不规则的组织的力学特性是基本不可能的，因为微生物的细胞壁，周质和其他结构的力学特性不能直接被测量。虽然如此，可以应用有效压痕模量来在不同细胞间进行力学特性的对比。本实验使用有效各向同性弹性模量（E）来进行比较。该弹性模量可由理想条件下对均一的，各向同性，平面的，现线性的，半无限的物质测量所得模型推算出。

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