该研究通过聚合酶链式反应（PCR）方法从生防木霉菌（Trichoderma guizhouense NJAU 4742）中成功克隆了几丁质结合蛋白基因。PCR测序结果表明，该基因全长1596 bp，编码531个氨基酸，其理论分子质量为46kDa。外源诱导表达纯化后得到纯蛋白，对其生物特性进行研究该内切几丁质酶最适温度为40℃，在30~40℃之间保持较好的热稳定性，最适pH为6.0，与Ca2+ 共反应内切几丁质酶活力有较明显提高，达到原酶活力的110.72%，而Co2+、Cu2+，Fe3+ 均表现出抑制作用，分别只有原酶活力的89.66%、65.83%和31.80%。
目录
摘要 3
关键词 3
ABSTRACT 3
KEY WORDS 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1材料 4
1.2 实验仪器 4
1.3 方法 4
1.3.1 聚合酶链式反应（PCR） 4
1.3.2 双酶切反应 4
1.3.3 酶连反应 5
1.3.4 热转化反应 5
1.3.5 蛋白的表达 5
1.3.6 蛋白的纯化 5
1.3.7 酶活的测定 5
2 结果与分析 6
2.1 酶的表达与纯化 6
3.2 酶的生物特征 7
3.2.1 不同pH对酶活的影响 7
3.2.2 不同温度对酶活的影响 8
3.2.3 不同金属离子浓度对酶活的影响 8
3.2.4 不同温度及不同时长下内切几丁质酶的热稳定性变化 9
3 讨论 11
致谢 12
参考文献 13
Trichoderma guizhouense NJAU4742 内切几丁质酶的研究
引言
引言：几丁质又称为甲壳素，是通过β1，4糖苷键将N乙酰D氨基葡萄糖连接而成的高分子多聚物[1]，广泛分布在真菌细胞壁及昆虫、甲壳类动物、线虫的外骨骼中，是自然界中分布最广泛的氨基多糖。几丁质的脱乙酰化产生壳聚糖，含有GlcNAc和d葡萄糖胺（G *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
lcN）的聚合物，后者通常超过残留物的约80％。[2]几丁质和壳聚糖因其生物相容性，无毒性以及丰富且廉价的生物质的可获得性而被用作食品、健康或农业领域的功能性材料。但是两种高分子量的生物聚合物在中性pH值条件下溶解性差，从而限制了它们在各个领域中的潜在用途[35]，不过这个问题可以通过使用它们衍生出的低聚物和单体来克服。实际上，壳寡糖（来自几丁质或壳聚糖的低聚糖，COS）的生物活性已得到充分证明，它们具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗高血压、抗肿瘤及益生元的作用，壳寡糖的作用在很大程度上取决于其分子量大小及所带电荷量。然而，由于技术等原因，能够成功应用于商业化生产的很罕见，这使得它们的使用非常受到限制。
COS可以通过使用几丁质酶（或壳聚糖酶）的酶促转化或化学降解方法来产生。其中，与需要极端反应条件的化学降解方法相比，酶促转化是一种更环保、可控、弹性的方法。[6]几丁质酶是广泛分布的糖苷水解酶（GH），其在几丁质的内部或末端β1,4糖苷键处随机切割，产生COS、二乙酰壳聚糖（（GlcNAc）2）和GlcNAc单元。[7]随着工业科技的发展，对酶的生物技术需求也在增长。因此，提高几丁质酶及其产物的生产效率是目前的一大挑战。
虽然几丁质的降解产物具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗高血压、抗肿瘤及益生元等作用，拥有着广阔的开发前景，但目前普遍采用的还是化学降解法， 此方法会对环境有着严重的影响。而几丁质酶的酶促转化方法更为环保，但由于几丁质酶的发酵分离、提取工艺等技术还不够成熟，导致分离出的几丁质酶酶活达不到标准，使其在工业化生产中受到了很大的限制。本试验以几丁质作为底物，在不同的温度、pH值、重金属离子浓度下测定了内切几丁质酶的活性以及内切几丁质酶在不同温度下的热稳定性，旨在为几丁质酶的应用提供坚实的理论基础。
1 材料与方法
1.1材料
菌株（实验室保存）：Trichoderma guizhouense NJAU4742，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌BL21；质粒pet29a（实验室保存）；限制性内切酶EcoR I，Kpn I（购自TAKARA公司）；Kanamycin Sulfate（购自GENVIEW公司）；细胞裂解液（50 mL体系：1 M Tris（pH 8.0） 2.5 mL、5 M NaCl 4 mL、0.1 M PMSF 50 μl、50%甘油 5 mL、dd H2O 38.45 mL）；几丁质（购自源叶公司）；3，5二硝基水杨酸（DNS）试剂参考[8]配制；蜗牛酶几丁质（购自源叶公司）。
1.2 实验仪器
酶标仪（Spectra max M5，Molecular Devices）、水浴锅（上海）、PCR仪（ABI公司）、电泳仪（伯乐公司）、蛋白纯化仪（伯乐公司）
1.3 方法
1.3.1 聚合酶链式反应（PCR）
以反转录得到的产物cDNA为模板，用内切几丁质酶基因的上游引物和下游引物，分别扩增DNA片段。
PCR反应体系：在普通白色PCR管中加入5×PrimeSTAR® Buffer（Mg2+ plus）10 μl，dNTP Mixture（各2.5 mM）4 μl，Primer 1（10 μM）1μl，Primer 2（10 μM）1 μl，cDNA 1 μl，PrimeSTAR®HS DNA Polymerase（2.5 U/μl）0.5 μl，灭菌蒸馏水32.5 μl，总反应体系50 μl，每个样品进行两个重复。
反应条件：98 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min/kb，循环30次，72 ℃，10 min，10 ℃，10 min。
1.3.2 双酶切反应
用限制性内切酶EcoR I，Kpn I双酶切pet29a质粒，回收酶切产物，再用EcoR I，Kpn I双酶切PCR回收后的产物DNA，再回收酶切产物。

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