从秸秆堆肥中筛选出的五株嗜热真菌，其均可以在55-60 ℃高温下正常生长，为了研究它们在不同碳源中联合培养时胞外蛋白分泌差异，试验设计为五株嗜热真菌在水稻秸秆和结晶纤维素为碳源中联合培养，比较其胞外蛋白差异以及水解酶活力差异情况。结果表明，以水稻秸秆作为碳源的体系中分泌的胞外蛋白酶活力比以结晶纤维素作为碳源的体系的高，其中在第5天时，其内切葡聚糖酶活力相差1 U·mL-1，β-葡萄糖苷酶活力相差为4 U·mL-1，外切葡聚糖酶活力相差2 U·mL-1，木聚糖酶活力相差3 U·mL-1；水稻秸秆体系中分泌156种胞外蛋白，微晶纤维素体系中分泌28种胞外蛋白，其中两个体系中的水解酶占所有酶的大多数，为65.12%；对于五株嗜热真菌来说，烟曲霉分泌的胞外蛋白占比最多，占比为91.12%。综合说明，五株嗜热真菌在水稻秸秆为碳源中联合培养时，产生比以结晶纤维素为碳源时更多的胞外蛋白种类和数量，并且以水解酶为主；并且烟曲霉能比其他真菌更加高效的、稳定的分解纤维素类物质。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1菌株的筛选与鉴定 2
1.2菌株的联合培养 2
1.3菌丝蛋白的浓度测定2
1.4胞外蛋白的提取鉴定2
1.5胞外蛋白的浓度测定3
1.6纤维素降解酶活力测定3
1.7蛋白质定性分析3
2结果与分析3
2.1菌丝蛋白的结果与分析3
2.2胞外蛋白的结果与分析4
2.3酶活力测定的结果与分析5
2.4蛋白质定性的结果与分析6
3讨论8
4结论8
致谢8
参考文献8
堆肥中筛选出的嗜热可培养真菌在不同碳源中联合培养的胞外蛋白分泌差异的研究
农业资源与环境学生 曹双杰
引言
引言：在人类社会不断发展、科学技术不断进步的同时，人类为满足自身活动的需要，在社会生产和日常生活过程中会产生大量的有机固体废弃物。随着其产量急速增长，有机固体 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: &351916072& 
废物累积和对环境污染日趋严重，对于它的处理处置已成为人类面临的重要问题之一。而堆肥作为一种保持良好环境效应的产物，具有生物处理的可持续性和废弃资源的循环利用等特征，这使得其成为处理有机固体废弃物的有效方法之一。有机固体废弃物的腐熟降解是由微生物作用发生的，有资料表明可高效降解农业废弃物的菌种高达上百种，主要包括纤维素降解菌、半纤维素降解菌和木质素降解菌[1]。研究者发现，在好氧堆肥过程中，对纤维素、半纤维素和木质素这几类不易被分解的有机物质具有降解能力的微生物主要是高温放线菌和高温真菌[2]。也就是说在高温堆肥过程中，嗜热真菌是分解纤维素类物质的中坚力量之一。有研究表明优良真菌菌株的混合培养会增加其对纤维素类物质的降解能力[3]，有目的地构建稳定的复合菌系将是环境微生物应用上的另一条非常有效的途径[4]。因此研究堆肥中嗜热真菌的联合培养时，其胞外蛋白分泌非常有必要，也对未来有机固体废弃物的堆肥化处理技术的进步有一定的意义。
1 材料与方法
菌株筛选与鉴定
从秸秆堆肥中，用稀释涂布的方法分离其中可培养嗜热真菌，它们均可以在55 ℃条件下正常生长，然后对它们进行Its鉴定，结果为五种嗜热菌株，它们分别是烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus），嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum)以及樟绒枝霉（Malbranchea cinnamomea），根霉菌（Rhizopus microsporus）和常见的嗜热棉毛菌（Thermomyces lanuginosus），为了探究它们联合培养在不同碳源中分泌的胞外蛋白差异，故选秸秆和结晶纤维素作为碳源进行培养。
菌株的联合培养
首先选择水稻秸秆（Rice straw，RS）和微晶纤维素PH101（AvicelPH101，Av）作为碳源，水稻秸秆主要成分分为两类物质，一类是易于降解的蛋白质、矿物质、脂类等，另一类是难降解的纤维素和木质素，占秸秆干物质含量的70%左右，其中约35%为纤维素，25%为半纤维素和10%为木质素[5]，水稻秸秆作为天然生物质材料，它含有丰富的半纤维素成分, 可作为微生物生长的良好基质, 为微生物生长提供所需的碳素。此外, 纤维质材料中还含有其它丰富的营养成分, 能为微生物生长供给所需的部分生长因子。PH101，是一种纯净的纤维素解聚产物，是纤维性植物的纸浆制得的α纤维素精制而成的，有很高的化学和生化纯度。碳源是真菌等微生物生长发育所需碳素的主要来源，而微生物对碳素物质的利用具有选择性，故而，不同的碳源类型对微生物产生的酶的量和类型都具有重要的影响。
将五株嗜热真菌分别联合培养于添加1%碳源的MS培养基中，用纱布封口，在55 ℃、10000 rpmmin1震荡下进行液体培养5天。
菌丝蛋白浓度的测定
采用Benndorf等人[6]的NaOH处理提取的方式。本试验中用0.1 mol/L的NaOH的处理使得蛋白质从微生物中释放出来。但是蛋白质的提取率很低,要通过预培养和接种才可获得足够分析的蛋白质含量[7]。实验中将第五天的体系用4层纱布把菌株和未分解的碳源物质过滤下来，并保存滤液，用1%的氢氧化钠溶解菌丝测生物量，测出菌丝蛋白浓度。
胞外蛋白的提取鉴定
将上述滤液过0.45 um的水性膜，剩下的液体在10000 rpmmin1、4 ℃下进行离心10分钟，所得到的上清液即为粗蛋白，将粗蛋白稀释20倍，用硫酸铵处理，再用透析袋透析其中的盐类，降低盐浓度，24 h内换液34次，即可得到浓缩后的胞外蛋白，将其用1.5 ml离心管分装测定。
1.5 胞外蛋白的浓度测定
取经适当稀释的粗酶液10 μL加入到96孔板的样品孔内，每个样品添加3个平行，向样品中加入200 μL的BCA工作液 (样品与工作液的体积比为1：2) 并混匀，在37 ℃水浴30 min后冷却到室温，在562 nm波长下测定吸光值。将配制好的体系37 ℃下，水浴反应半个小时，然后冷却至室温，并在562 nm波长下测定其吸光值，根据标准曲线，计算出样品中的蛋白质含量。

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