功能微生物的孢子形成对包括微生物肥料在内的农用微生物菌剂的产量和品质影响显著，故对相应功能微生物的产孢机制进行研究，意义重大。本研究以两株重要功能木霉菌株哈茨木霉T. harzianum和贵州木霉T. guizhouense为材料，以产孢相关的疏水小蛋白基因(hfb)和细胞自噬相关基因(atg)为研究对象，检测两个基因家族关键基因的表达特征，探究其与木霉菌产孢机制的关系。试验设置3个采样区域，分别为产孢区内测（Q区）、产孢区（B区）及产孢区外侧（H区），两个时间点，对平皿培养的木霉菌体进行RNA提取和定量PCR检测。结果显示，相对于产孢临近区域（Q和H区），自噬相关基因atg和疏水小蛋白基因hfb均在产孢区域（B区）大量表达，表明相应蛋白在该区域存在显著的富集现象；而在产孢后期，则相应趋势有所减弱，采样区基因表达差异减小。且菌株间基因表达谱差异显著，在哈茨木霉产孢区hfb3和hfb4表达升高，而在贵州木霉中hfb2、hfb3和hfb4均大量表达；而两者的atg表达谱相近，主要基因均在产孢区（B区）表达较为显著。因此，我们猜测，由于木霉孢子表面需要大量的HFB蛋白以形成表面疏水结构，而气生菌丝中大量的HFB积累则可通过自噬过程分泌至孢子表面，使得孢子发育成熟，便于传播。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言3
1材料和方法3
1.1.1供试菌株 3
1.1.2供试培养基 3
1.2实验设计 3
1.3基因序列收集与引物设计4
1.4数据分析5
2结果与分析5
2.1供试木霉hfb基因和atg基因表达的聚类分析5
2.2供试木霉atg基因和hfb基因的表达规律6
2.3供试木霉atg基因和hfb基因的表达量变化7
2.3.1疏水小蛋白基因(hfb)的表达量变化8
2.3.1自噬相关(atg)基因家族的表达量变化8
3讨论 8
3.1 自噬相关基因(atg)在供试木霉产孢过程中的作用9
3.2 疏水小蛋白基因(hfb)在供试木霉孢子形成过程中的作用10 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072& 

3.3 两种产孢相关基因的相互关系11
4结论12
致谢13
参考文献14
自噬相关基因和疏水小蛋白基因在木霉产孢过程中的表达模式
引言
引言
木霉（Trichoderma）是一类重要的防治植物病害的生防真菌与促生真菌，广泛分布于潮湿的森林、草原、土壤、腐木、落叶以及其他真菌的子实体上[1]。1932年，Weinding[2]首先发表了T. lignorum木霉对几种土壤真菌的拮抗作用的研究结果。Chang等人[3]的研究指出，哈茨木霉(T. harzianum)对植物病原真菌的拮抗及对植物的促生作用效果显著。
与此同时，大量的田间实践表明，由木霉菌制成的微生物菌剂，包括微生物肥料，具有极高的农业应用价值，但田间效果不稳定；其中，保证木霉菌剂施用效果的关键因子可以是提高菌剂的孢子含量从而保证木霉菌的定殖率。传统手段上，许多研究者优化了木霉的产孢条件，如刘万斌[4]通过调节培养基物料配比与条件，筛选出适合绿色木霉HS4菌株的最优固体发酵产孢基质；池玉杰等人[5]也探索并优化了木霉产孢的最适温度、pH及初始接菌量等条件。然而，对于木霉孢子形成过程的分子生物学机制研究并不透彻，鲜有相关报道。近年来，有研究表明自噬Autophagy(简写为ATG)相关的蛋白及分泌型疏水小蛋白Hydrophobin(简写为 HFB)参与了木霉孢子形成及成熟的生物学过程[6,7]。
故本研究以重要农用功能木霉菌株为材料，着重研究atg和hfb基因家族在产孢过程中的表达特性，探讨相关基因家族与木霉产孢机制的关系及其生物学作用，为进一步提高木霉菌剂孢子含量提供技术支持。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1 供试菌株 贵州木霉T. guizhouense NJAU 4742(下文简写为4742)筛选自中药渣，其制成的微生物菌剂已在我国商业化应用；哈茨木霉T. harzianum CBS 226.95(下文简写为916)筛选自土壤，为哈茨木霉国际标准菌株；供试菌种由本实验室保藏。
1.1.2 供试培养基 如无特殊指出，本试验均以BD公司(Becton and Dickinson Company)生产的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（DifcoTM Potato Dextrose Agar，PDA)培养：称取PDA粉11.7g与1L去离子水混合均匀，灭菌后倒入于一次性9cm平皿中,每皿15mL。
1.2试验设计
菌种活化：将80℃保藏的4742和916 菌株孢子以 OD600 = 1的浓度分别接种于 PDA固体培养基中，于25℃培养 48h。
扩大培养：用灭菌后的打孔器打孔获得5㎜菌块，以灭菌接种铲将菌块分别接种至新鲜PDA培养基一端（O点，见图1），于25℃黑暗倒置培养。
产孢前预培养：将 4742和916分别培养61h和48h后，在超净台内打开培养皿盖，再次密封，置于光照培养箱中25℃继续培养；开始光照培养，此时记为0h。


图1 供试菌株采样位置示意图
Figure 1 Schematic diagram of sampling position
(a)916光照培养48h; (b)916光照培养48h; (c)4742光照培养29h; (d)4742光照培养58h
取样：将各菌株在光照下继续培养，如表1所示，达到规定培养时长后，挑选产孢圈及生长速度等形态特征相似的平皿各6个；用枪头分别在产孢圈外侧（H区）、产孢圈（B区）、产孢圈内侧（Q区）3处（如图1所示）刮取菌丝，将其迅速放入1.5mL离心管中，液氮速冻 5min，置于80℃冰箱保存备用；每次采样设置三个生物学重复。
表1培养时长与取样点
Table 1 Sampling timepoints and positions
菌株
培养时间(h)
采样区域
产孢区内侧(Q)
产孢区(B)
产孢区外侧(H)
916
24
9161Q
9161B
9161H
48
9162Q
9162B
9161H
4742
29

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