【目的】通过外源表达方法构建载体重组毕赤酵母，高效表达贵州木霉NJAU4742内切葡聚糖酶基因eg-II，探究酶学性质。 【方法】以稻草作为贵州木霉NJAU4742菌株的唯一碳源进行液体发酵，提取菌株的RNA并通过反转录获取内切葡聚糖酶基因eg-II的cDNA，以PCR扩增法获得的cDNA 序列，运用双酶切手段以及酶连方式，在pPICZαA表达载体上准确插入cDNA 片段，获得重组质粒。采用电转化法将重组质粒转入毕赤酵母中，获取准确突变子。准确突变子经过培养基诱导发酵，获得胞外分泌的EG-II内切葡聚糖酶，对其进行分离纯化，探究其酶学性质。【结果】表达的这个酶具有高效的酶活性。酶学分析结果表明，EG-II拥有最适温度以及温度稳定性，最适pH以及适宜pH稳定性。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1．1 实验材料 2
1．1．1 化学试剂 2
1．1．2 菌株与质粒 2
1．1．3 酶与试剂盒 2
1．1．4 培养基 3
1．2 实验方法 3
1．2．1 表达载体构建 3
1．2．2 毕赤酵母感受态制备 5
1．2．3 毕赤酵母电转化 6
1．2．4 筛选多拷贝转化子 6
1．2．5 菌落PCR验证 6
1．2．6 产酶诱导发酵 6
1．2．7 产酶发酵液SDSPAGE分析 6
1．2．8 酶的浓缩和纯化 6
1．2．9 酶活测定 7
1．2．10 酶学性质分析 7
2 结果与分析 7
2．1 基因egII序列分析 7
2．2 egII与载体双酶切验证结果分析 8
2．3 酵母转化子PCR验证结果分析 8
2．4 内切葡聚糖酶egII异源表达与纯化 9
2．5 内切葡聚糖酶基因EGII最适温度和温度稳定性研究 10
2．6 内切葡聚糖酶EGII最适pH以及pH稳定性研 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
究 11
3 讨论 12
致谢 13
参考文献： 13
贵州木霉NJAU4742内切葡聚糖酶基因egII的毕赤酵母异源表达及其酶学性质研究
引言
环境以及资源问题是当今社会中人类所面临的最重要且严峻的危机之一。地球生态环境中，具有可再生能力的同时兼具广泛分布且廉价特性的资源只有纤维素。全球植物每年通过光合作用产生的干质量近200亿吨，其中纤维素含量比例超过50%。目前对于这类可再生生物资源的降解利用却受限于木质纤维素的一个重要性质——具有复杂且稳定的交联结构。纤维素外围被木质素层包围，且高结晶构造不溶与水，因此很难将其直接水解成可利用的葡萄糖，到目前为止仍然没有找到适宜的利用办法[1]。伴随着世界人口骤长、资源短缺等一系列社会问题日益显著，为解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等热点社会问题，探究如何利用纤维素酶发展生物工业，实现纤维素的生物转化与利用是具有重要现实意义[2]。现阶段研究表明，仅凭化学法和物理法都难以将其完全降解[34]，酶解法拥有低能耗、反应条件温和、环境友好等优点[56]，使之逐渐成为各国研究人员关注热议的焦点。但纤维素酶的工业化生产与市场推广应用现状并不乐观，目前纤维素酶依然存在较低的酶活利用率以及高昂的生产成本。正因如此，世界各界学者越发关注纤维素酶的研究，更加重视纤维素酶的工业应用。
木霉是一种工业常用的生防菌剂，有较为完整的纤维素酶系，可以产生多种胞外纤维素酶，尤其对结晶纤维素有较好的酶解活性，它是最高效的纤维素水解酶之一，因而备受关注。主要研究的木霉有长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康氏木霉(Trichodermakonningii)、拟康氏木霉 (Trichoderma pseudokoningii)、瑞氏木霉(Trichoderma reesei)等。现研究成果显示，木霉产生的纤维素酶包括三类：内切β14葡聚糖酶(endoglucanases, EG, EC.3.2.1.4)、β葡萄糖苷酶(βglucosidases, BG, EC.3.2.1.21)和外切β14葡聚糖酶(cellobiohydralases, CBH, EC.3.2.1.91)，这些酶隶属于葡萄糖苷水解酶家族(Antonella et al., 2013)。将木质纤维素完全水解为葡萄糖的必需条件是三种纤维素酶共同的表达作用。内切葡聚糖酶水解纤维素的生物机制很关键，内切葡聚糖酶随机切割纤维素长链内部的非结晶区，进而降低纤维素结构的完整性，使纤维素水解产生一定量的小分子多糖。其中内切β葡萄糖苷酶优先作用于无定型纤维素，并从纤维素分子内部进行水解[7]。在木霉纤维素酶系中，微生物内部的调控机制管控调节各组分纤维素酶比例，很难以调控培育条件等方式完成人工调节。而在纤维素酶不同的工业生产中对各组分比例往往有着不相同的要求，举例在纺织品水洗环节中，需求较高相对活性的内切β葡萄糖苷酶，这种情况下，由木霉直接合成的纤维素酶不可满足工业批量化生产的需求。为了解决这些问题，现部分研究者试图利用基因工程技术设计木霉菌株，以增加纤维素酶系中某纤维素酶含量的比例，人工干涉控制从而取得预期的效果[810]。
通过外源表达手段构建重组毕赤酵母实现贵州木霉NJAU4742内切葡聚糖酶基因egII的高效表达，对于提高作物的产量、改善作物的品质具有重要的意义，并为实际生产提供理论依据。采用合适的表达系统单独表达贵州木霉NJAU4742酶系的纤维素酶，就能提高木霉中的纤维素酶活性从而提高纤维素的降解，达到改善农业固体废弃物资源化利用的目的。本文依据当前国内外此类课题的研究现状和研究进展对此研究进行分析。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 化学试剂
AR纯羧甲基纤维素钠（CMCNa）；AR纯纯山梨醇 (Dsorbitol)；AR纯甘油（Glycerol）；AR纯酵母 (Yeast Extract)；AR纯氯化钠 (NaCl)；AR纯硫酸铵（(NH4)2SO4）；AR纯胰蛋白胨 (Peptone)；AR纯博莱霉素（Zeocin）；AR纯甲醇(Methanol)。
1．1．2 菌株与质粒

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