天冬酰胺合成酶是氨基转移酶家族的众多成员之一，可以用来催化天冬酰胺(Asparagine Synthetase ,ASN)的合成，从而为蛋白质的合成提供原料。在植物体中，硝酸盐等无机氮在木质部运输，然而在韧皮部中则以天冬酰胺的形式运输。天冬酰胺碳氮比高，溶解性强于酰脲，也比谷氨酰胺或其他酰脲更加的稳定，在生理溶液(pH 2~10)中的移动性更强，因此天冬酰胺更适合用来运输化合物。在拟南芥种子和新叶中天冬酰胺参与新陈代谢，而在成熟叶片中不需要氮来生长，所以天冬酰胺不再参与新陈代谢，而被运输到正在生长的种子和叶中。为了探索天冬酰胺对水稻生长发育影响的机制，本次实验拟对天冬酰胺合成酶突变体材料进行分析。通过比较野生型和ASN1突变体材料株系生长状况，了解天冬酰胺合成酶对水稻株型生长的影响。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 实验材料 2
1.1.1 水稻的品种2
1.1.2 主要的试剂2
1.2 实验方法 2
1.2.1 水培方法2
1.2.2 DNA的提取3
1.2.3 PCR扩增测序3
1.2.4 表型观察4
1.2.5 分蘖芽形成和伸长的观察4
2 结果与分析4
2.1 OsASN1突变体材料鉴定5
2.1.1 OsASN1突变体材料的获得与分子鉴定5
2.1.2 OsASN1CRISPR突变体材料突变位点鉴定5
2.2 OsASN1突变体材料表型分析6
2.3 OsASN1突变体材料分蘖芽形成和伸长的观察 8
3 讨论9
致谢12
参考文献13
附录一 IRRI营养液配方15
图1两轮PCR鉴定TDNA插入纯合突变体5
图2 TDNA插入位点鉴定及突变体表型5
图3载体特异片段Cas9检测6
图4通过CRISPR/Cas9获得的OsASN1基因敲除突变6
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ASN1基因敲除对分蘖芽生长的影响9
表1野生型和突变体在5L培养箱中培养30天表型统计（平均数，标准差）7
表2野生型和突变体在7L培养箱中培养30天表型统计（平均数，标准差）7
表3野生型和突变体在5L培养箱中培养40天表型统计（平均数，标准差）8
表4野生型和突变体在7L培养箱中培养40天表型统计（平均数，标准差）8
天冬酰胺合成酶基因ASN1突变对水稻株型的影响
引言
引言
氮代谢是植物重要的基本生理过程之一，谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸及天冬酰胺都是植物运输系统中常见的氨基酸[1]。天冬酰胺(asparagine，ASN)具有较高的稳定性和碳氮比(2∶4)，因此它是一个理想的氮运输及贮藏工具，是植物的氮代谢过程中有机氮运输、储存的主要形式之一[2]。在高等植物中，天冬酰胺的生物合成是由天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase，AS)催化而成的[3]。
天冬酞胺合成酶是氨基转移酶家族的主要成员之一，其可以催化合成天冬酸胺,从而为蛋白质的合成提供原料。在植物体中,天冬酞胺合成酶是主要催化谷胺酸氨和天冬氨酸生成谷胺酸和天冬酸胺,而天冬酞胺又是很重要的运输氮化合物。生长旺盛的种子、根、叶需要大量的氮来合成氨基酸、蛋白质等[4]。在植物体中硝酸盐等无机氮在木质部运输,而在韧皮部中则以天冬酞胺的形式运输,天冬酞胺氮碳比高,溶解性比酞脉更强,比谷氨酞胺或者其它酞脉更稳定,在生理溶液中移动性更强。因此天冬酞胺是适合运输化合物的角色[5]。
在植物中天冬酰胺的生物合成是由天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase, AS)催化而成的。AS通常由一个小的基因家族所编码[6]。目前对拟南芥AS基因家族的研究较为全面详尽[6,7,8,9,10]。在拟南芥中，过表达ASN1基因(拟南芥AS基因的家族成员之一)能够增强氮从源组织到库组织的重新定位，从而来增加种子中的氮水平，蛋白质含量[9]。研究表明，大豆叶片中的AS1转录水平越高，天冬酰胺代谢就越活跃，植株同化后转运的氮也就越多，同时，种子中积累的贮存蛋白也会越多，因此AS1表达水平可以作为大豆育种中筛选高(或者低)蛋白质含量种质的一个有效标记。
在水稻植株的韧皮部汁液中，转移氮分子的主要的形式是谷氨酰胺，其次是天冬酰胺[11]，这与大豆等其他作物以天冬酰胺作为转运氮的主要形式不同[12]。已有的研究表明，AS蛋白在水稻的剑叶完全展开和灌浆中期时的叶鞘和籽粒中含量较高，随着籽粒的成熟，直至开花后的21d时，AS蛋白含量呈现增长趋势，而在此之后迅速的下降；同时OsAS基因mRNA的积累也可以在上述组织中观察到。由此可见，在水稻中，OsAS基因的表达水平的高低可能与其氮同化及转运有着密切的联系。
天冬酰胺是多种植物用以长距离转运的初级氮化合物，其在植物的生长和发育中发挥者重要作用。然而，植物中的天冬酰胺合成酶基因的作用在水稻中，尤其是其对氮利用的影响的相关研究依旧很缺失。通过使用氨基酸柱前衍生化HPLC方法准确测量几种氨基酸的含量，并联系不同的突变体氮代谢的差异以及不同的突变体生长表型的不同来探讨天冬酰胺合成酶ASN1突变对水稻株型的影响。在水稻中，天冬酰胺是韧皮部和木质部的汁液里氮素的主要形态之一。本次研究拟对通过天冬酰胺合成酶的突变体材料进行分析，来探索天冬酰胺对水稻的生长发育影响的机制，从而最终达到在农业生产中，使水稻弄够更好的生长发育，以及增加水稻的抗病性和抗逆性，提高水稻产量等，提高农业收益的目的。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 水稻的品种
日本晴（Oryza sativa L, ssp. japonica）；Hwayoung；以Hwayoung为背景的OSASN1 TDNA插入突变体3D02739，以日本晴为背景的转基因株系（杂合体：AS 12 701，AS 11 5；纯合体：AS 12 63 插A，AS 13 852 插入A，AS 13 87 少CCG，AS 12 62 少TGC，AS 11 11 插入TT，AS 12 65 TAGCT变为A）。

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