泛素-26S蛋白酶体途径是一个关键的蛋白降解体系，通过有选择性的清除细胞内的异常蛋白和半衰期较短的调节蛋白，调控多种细胞发育进程。拟南芥PTRE1(PROTEASOME REGULATOR1)是动物蛋白酶体活性调控因子PI31(Proteasome Inhibitor 31)的同源蛋白，功能缺失突变体ptre1表现出多重生长发育缺陷。PTRE1促进26S蛋白酶体的活性，并协调TIR1介导的AUX/IAAs蛋白降解以调控生长素信号。酵母互作检测结果表明PTRE1可以与自身相互作用。为了探索PTRE1自身互作的结构域，我们将编码PTRE1不同结构域的片段构建到pGADT7和pGBKT7载体中，得到了PTRE1N-AD、PTRE1N-BD、PTRE1C-AD、PTRE1C-BD四个表达载体，并通过酵母双杂交实验初步证明了PTRE1的C端胞外结构域参与了PTRE1的自身互作。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 质粒2
1.1.2 菌株2
1.1.3 抗生素3
1.1.4 引物3
1.1.5 培养基与溶液3
1.1.6 试剂3
1.1.7 主要仪器3
1.2 方法3
1.2.1 引物设计与PCR扩增目的基因3
1.2.2 PCR产物回收与酶切反应4
1.2.3 目的基因与载体连接4
1.2.4 转化大肠杆菌HD5α4
1.2.5 菌落PCR扩增5
1.2.6阳性克隆扩大培养5
1.2.7提取质粒酶切鉴定与测序5
1.2.8 酵母双杂交实验5
2 结果与分析6
2.1 表达载体的构建6
2.1.1 PCR扩增目的基因6
2.1.2 酶切反应6
2.1.3菌落PCR扩增6
2.1.4提取质粒酶切鉴定及测序7
2.2 酵母双杂交检测PTRE1自身互作结构域7
3 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072* 
讨论 8
致谢9
参考文献9
附录A11
附录B12
附录C13
拟南芥蛋白酶体活性调控蛋白PTRE1自身互作结构域研究
引言
泛素26S蛋白酶体降解体系是目前已知最重要的蛋白降解体系[1]，在动植物发育过程中起着重要的调控作用，Aaron Ciechanover, Avram Hershko和Irwin Rose也因发现了泛素介导的蛋白质降解过程而获得了2004年诺贝尔化学奖。蛋白降解体系可有效降解细胞内异常或过量的蛋白从而调控植物的生长发育以及适应外界环境变化；与此同时，蛋白降解还受到外界环境和发育过程中不同信号的调控，以保证细胞中合适的蛋白丰度[2]。现在的研究发现泛素26S蛋白酶体降解体系几乎参与到植物生长发育的整个过程，包括激素信号调控、细胞周期控制、胚胎发育、逆境响应、表观遗传、抗病以及光形态建成等[36]。
蛋白的泛素化依次需要E1（泛素激活酶），E2（泛素结合酶）和E3（泛素连接酶）的参与，经过一系列级联的酶促反应，在靶蛋白底物上形成泛素聚合链，为26S蛋白酶体特异性的识别和降解底物蛋白提供信号[6,7]。26S蛋白酶体是一个约2400kDa的大蛋白复合体，分布在细胞质和细胞核中，在真核生物的进化中具有高度的保守性[8,9]。没有ATP存在时，26S蛋白酶体分解为2个19S调节复合体和1个20S核心复合体。19S调节复合体又称为PA700(Proteasome Activators 700)，可以分为两个组分，盖子(Lid)和基座(Base)[10,11]，前者负责泛素化蛋白的识别以及去泛素化，后者负责靶蛋白去折叠化[12]。20S核心复合体位于两个19S调节亚基的中间，具有除丝氨酸蛋白酶之外的多种蛋白酶活性，可以将几乎所有进入蛋白酶体内部的靶蛋白降解为短肽，被释放后用于新蛋白合成[6]。
越来越多的证据表明，26S蛋白酶体的活性是被调控的。早期的研究主要是在动物中进行的。蛋白酶体活性调控蛋白PI31(Proteasome Inhibitor 31)从牛血红细胞[13]中第一次被分离纯化出来，随后鼠[14]和人[15]的PI31也依次被分离出来。PI31是一个富脯氨酸蛋白，可以竞争性结合20S蛋白酶体从而抑制其活性，也可以阻断两个重要的激活子PA700(19S)和PA28(11S)对26S蛋白酶体的激活。PI31可以形成同源二聚体，也可以和Fbox家族成员 Fbxo7结合形成异源二聚体[16]。2011年Bader等发现线虫的DmPI31可以体外促进26S蛋白酶体的活性，这是在动物中第一次发现PI31对26S蛋白酶体活性有促进作用[17]。
在很长的时间内，植物蛋白酶体活性调控蛋白的研究一直都是空白的。直到2016年，杨等鉴定了一个拟南芥中PI31的同源蛋白PTRE1 (Proteasome Regulator 1)，PTRE1的体外纯化蛋白同样表现出对20S蛋白酶体活性的抑制和对26S蛋白酶体活性的促进。PTRE1功能缺失突变体ptre1同野生型Col0相比，26S蛋白酶体的活性下降了约40％。ptre1表现出多重生长发育缺陷，包括植株弱小，莲座叶小且向背面不规则卷曲，果荚长度短且出现种子缺失、育性显著降低，向光反应受到抑制等。功能研究表明PTRE1介导了生长素对蛋白酶体活性的调控，并协调TIR1介导的转录抑制因子AUX/IAAs蛋白降解以调控生长素信号。进一步的研究表明生长素促使PTRE1在细胞膜上积累并降低其在细胞质和细胞核中的分布从而调控蛋白酶体活性[18]。
26S蛋白酶体作为所有泛素化蛋白的最终目的地，目前对其活性调控和蛋白酶体亚基具体功能的研究并不深入。虽然PTRE1的发现为植物中26S蛋白酶体活性调控的研究提供了线索，但PTRE1的具体作用机制和调控网络尚待进一步完善。后续的酵母双杂交实验结果表明PTRE1可以与自身相互作用，猜测与其发挥功能相关。PTRE1蛋白中间2544位氨基酸为跨膜结构域，N端124位氨基酸位于细胞质中，而C端45302位氨基酸暴露在质膜外。我们构建了融合不同结构域的表达载体，通过酵母双杂交实验初步检测了PTRE1自身互作的结构域，希望为PTRE1的功能研究提供线索。

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