水稻PHT1家族成员在磷素吸收、转运和分配方面起着非常重要的作用，它们之间的关系错综复杂，可能在空间和时间上存在着某种功能互补或功能冗余，同时又一起在植物体内相互协调和配合，形成一个庞大的磷运输网络。本课题在对一个正在研究的水稻磷转运蛋白基因OsPHT1;3的超表达材料和突变体材料中PHT1家族其他成员的表达丰度研究时发现，有好几个成员的表达在OsPHT1;3的超表达材料和突变体材料中呈现相反的结果。水稻PHT1家族中另外一个已经报道的成员OsPHT1;8也有类似的结果。我们猜测水稻PHT1家族成员之间普遍存在着互作关系。我们进一步利用Split-ubiquitin 酵母双杂交试验来验证我们的猜想。实验结果表明大部分 PHT1家族成员之间均存在着不同程度的互作，其中我们所研究的一个成员，即OsPHT1;3，可以与OsPHT1;2、OsPHT1;4、OsPHT1;5、OsPHT1;6互作。我们的研究结果加深了水稻对磷素吸收转运机理以及磷转运蛋白协调参与磷素吸收和转运的认识，我们的研究结果为以后的磷转运蛋白研究提供了新的思路和方法。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 试验材料 3
1.1.1 材料 3
1.1.2 菌株 3
1.1.3 表达载体 3
1.1.4 生化试剂 3
1.1.5 PCR扩增引物 3
1.2 试验方法 3
1.2.1 OsPHT1;3 超表达和突变体材料中PHT1 家族其他基因的表达情况3
1.2.2 酵母双杂交Splitubiquitin Y2H试验验证 PHT1家族其他成员与OsPHT1;3的互作4
1.2.2.1 Splitubiquitin Y2H载体的构建过程4
1.2.2.2 酵母感受态细胞的制备和质粒转化5
1.2.2.3 酵母打点试验验证水稻 PHT1 家族成员是否有互作关系作5
2 结果与分析5
2.1 OsPHT1;3 超表达材料中PHT1家族其他成员的表达的分析
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5
2.2 OsPHT1;3 突变体材料中PHT1家族其他成员的表达的分析6
2.3 OsPHT1;3 超表达材料和突变体材料中PHT1家族其他成员的表达对比的分析7
2.4 PHT1家族成员之间的互作关系的分析7
3 讨论 8
致谢9
参考文献9
附录 10
水稻磷转运蛋白OsPHT1;3与PHT1家族其他成员的互作功能研究
引言
磷素是植物生长的大量必需元素之一，同是也是磷脂、核酸、ATP等生物大分子的重要组成部分，在植物发育的过程中起到了非常的重要作用。缺磷会导致作物产量和品质的下降。耕地由于有效磷缺乏而导致农作物产量受到影响约占总耕地的40%60%[1]，有效磷含量的不足，作物难以吸收利用。增加耕地有效磷含量，提高植物吸收磷的能力是解决土壤磷缺乏的两个方向。中国是磷矿石大国之一，储量32.41亿吨[2]，但我国磷矿资源富矿少、中低品位矿多（近2/3属于难选矿）[3]。与此同时其他行业，如材料、食品、医药等，也需要大量磷素。世界粮农组织的统计年鉴显示我国单位耕地施肥量是世界平均量的4.6倍，远高于美日等发达国家。而磷肥当季利用率仅仅为15%，尽管在土壤中含量很高,但是它在土壤中的有效性却非常低,使其成为植物生长的一个关键限制性因子。而过量施肥就会导致水体富营养化，污染环境。目前植物缺磷主要是“遗传学缺乏”，耕地全磷含量得到明显的改善，但作物可以利用的有效磷仍然不足。如何缓解或解决土壤中可溶性磷含量不足，提高缺磷土壤中作物的生产力一直是土壤学科、植物营养学科、植物生理学科和遗传学科等研究工作者所普遍关注的问题。为了实现可持续发展，通过分子遗传技术来改良作物，提高对磷的吸收利用是解决农业生产缺磷状况的关键途径之一。
植物体内存在着一个庞大的磷酸盐转运蛋白成员家族，目前鉴定出的这些成员可以分成 PHT1，PHT2，PHT3以及PHT4四个亚家族[4]，它们之间的关系错综复杂，它们的作用机理可能相同又可能不同[5]。植物的一个多基因家族可以表达多种不同亲和的磷酸盐转运蛋白，这些转运蛋白可能在不同时空上相互作用，进而来吸收和转运土壤中的有效磷。这些家族的不同成员在植物生长发育过程中或是在各种生理生化和代谢过程中起着不同的作用。在大部分植物中，具有两套磷吸收系统，高亲和力系统的磷转运蛋白通常是诱导型表达，对磷的亲和力(Km)较高，其Km值一般在μM范围；低亲和力系统的磷转运蛋白通常是组成型表达，对磷的亲和力较低，其Km值一般在mM范围[6]。在植物中已发现的磷转运蛋白基因主要分为四个基因家族：Pht1, Pht2, Pht3, Pht4 [79]。
受低磷水平诱导表达的Pht1家族，可将细胞外低浓度的磷跨膜转运到细胞内[10]，因此该家族蛋白在作物缺磷条件下显得异常重要。该家族已在水稻、大豆玉米、小麦和拟南芥中被发现[11]。到目前为止， 在水稻中已鉴定了 13个属于Pht1家族的磷酸盐转运蛋白基因 OsPT1~OsPT13[1213]。这些基因编码的蛋白（除OsPT2外）绝大部分都属于高亲和力的磷酸盐转运蛋白，在水稻对磷素的吸收和转运过程中起着至关重要的作用，水稻Pht1家族成员中大部分的磷酸盐转运蛋白基因主要或者只在根部表达，受低磷环境或丛枝菌根真菌的侵染强烈诱导表达[14]。大部分已经克隆出来的植物磷转运蛋白基因属于H2PO4/nH+共运体，它们利用ATP提供的能量，通过质膜上的质子电化学势梯度差来驱动植物对磷素的吸收，后者又属于一个更大的溶质转运蛋白家族MFS。主要负责单一转运、溶质：阳离子或同向转运、溶质：阳离子（氢离子或钠离子）同向转运、溶质：氢离子或溶质：溶质反向转运过程，这一家族的基因主要负责植物对碟的吸收及体内磷的转运过程 [15] 。利用酵母中主要的高亲和磷转运子，即酵母突变体pho84/pho89进行酵母互补试验是Pht1家族转运子的磷转运动力学研究主要方式，但基于此的实验结果只能在一定程度上代表植物对磷的转运活力，运用植物悬浮细胞试验和瓜蟾卵母细胞试验更具代表性[16]。
Pht2家族是组成型表达的系统，是养分充足状态下营养元素的吸收系统，其Km值在mM范围。最先在拟南芥中被发现，并在叶片中优先表达，该基因编码低亲和力的磷转运蛋白[17]。目前已在拟南芥、水稻、苜蓿等高等植物中发现该家族成员。与此同时我们又在拟南芥、水稻、大豆、玉米等高等植物中发现了Pht3家族的成员Pht3家族的磷转运蛋白定位在线粒体膜上，负责线粒体磷的交换[9]。Pht4家族也在拟南芥中被发现，Pht4家族的磷转运蛋白参与了磷，有机阴离子，氯化物等的运输。

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