2Abstract2Key words2引言 31.材料与方法 31．1 试验材料 31．2 试验方法 31．2．1 材料培养 31．2．2 海滨雀稗总RNA提取和cDNA第一链合成 41．2．3 海滨雀稗WRKY家族13个基因全长的克隆与生物信息学分析 42结果与分析 52.1海滨雀稗13个WRKY家族基因全长序列的获得 52.2 海滨雀稗13个基因在5种胁迫下的表达 72.2.1根（Leaf）叶（Root）低温（4℃）胁迫 72.2.2根（Leaf）叶(Root)干旱（PEG）胁迫 102.2.3根(Leaf)盐 叶（Root）（NaCl）胁迫 1332.2.4根（Leaf）叶（Root）镉（Cd）胁迫 142.1.5根（Leaf）叶(Root) 币斑病（S.H.）胁迫 193.讨论 22致谢 22参考文献 22海滨雀稗WRKY家族基因克隆与表达分析草业科学 覃创羿本实验选材海滨雀稗，它在抗逆性方面有突出表现，适合在南方草坪的建植，特别是盐海滩涂地区的绿化。WRKY家族基因是参与植物逆境响应中一类重要的转录因子。本实验根据GenBanK中海滨雀稗的转录组数据，检索到WRKY家族的13个基因，利用RACE技术克隆出了海滨雀稗仅有中间片段的6个基因的全长序列，并采用qPCR技术分析了WRKY家族13个基因在盐、干旱、低温、镉等非生物胁迫和币斑病病原菌入侵的情况下表达的差异。实验结果表明13个WRKY家族基因在各种胁迫中都呈现不同的表达结果，为研究海滨雀稗抗逆分子机制奠定了基础。
目录
引言
引言
近年来，人们通过对植物体多番研究发现：其在各种逆境胁迫条件下，总有各种生理响应与之对应。WRKY基因就是参与调控这类生理响应的基因之一。这类基因以N－末端高度保守的WRKYGQK 氨基酸为核心。WRKY基因表达时，以WRKYGQK 氨基序列特异地结合下游目标基因的启动子Wbox序列，进而调控目标基因表达。这种结合方式说明了以Wbox序列为启动子区的基因均有可能受到WRKY氨基翻译出的WRKY蛋白的调控（Turck, et al., 2004）。由于多样的DNA结合位点使得WRKY转录因子能在植物基因转录调控网中发挥多种多样的作用，并且由于植物体不断进化，WRKY转录因子能选择更多的顺势作用元件，进而参与到更丰富的对 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
下游目标基因的调控(Machens, et al., 2014)。WRKY家族丰富的去路导致他们能参与到植物体各样的逆境胁迫响应。
本实验主要研究海滨雀稗在低温、干旱、盐害、病害、重金属等胁迫下WRKY基因的表达情况。低温胁迫：过量表达的BdWRKY36能有效减少ROS的积累，激活NtLE45抗性基因，增强植物抗旱性（Sun et al.,2015）。干旱胁迫：有研究表明，在外施ABA条件下，内源CmWRKY1下调，而在有水分条件下可促进CmWRKY1的表达（Song et al.,2014）。由ABA途径，CmWRKY1高度表达使DREB1A、DREB2A、CuZnSOD、NCED3A、NCED3B共5个转录因子表达活跃（Jaffar et al.,2016）。干旱条件下AtWRKY53在拟南芥中过量表达，能有效降低叶片保卫细胞中的过氧化氢含量，加快淀粉的代谢并使气孔闭合，实现对干旱胁迫的负调控（Sun, et al., 2015）。高盐胁迫：过量表达的AtWRKY57能直接同RD29A 和NCED3上的启动子Wbox特异结合，调控两基因的表达，以提高植物耐盐性（Jiang et al., 2012）。病害胁迫：病原菌的入侵引起植物体内源信号分子SA和JA及其衍生物分泌量迅速增加，实现对下游防御基因的表达（Pieterse et al.,2012）。其中AtWRKY50和AtWRKY51能促进SA合成（Gao et al.,2011），通过SA信号通路，AtWRKY48和AtWRKY46的过量表达能诱导ICS1和PBS3的表达，开启抗病生理响应过程（Verk et al.,2011）。重金属镉胁迫： ThVHAc1启动子上的Wbox序列能和怪柳ThWRKY7特异结合，开始转录激活，表明ThWRKY7具有提高植物耐受镉的能力（Gao et al.,2011）。
综上可以发现，WRKY转录因子往往是收到植物受胁迫信号，通过调控下游目标的基因的表达，实现植物抗逆性的提高。
1.材料与方法
1．1 试验材料
海滨雀稗‘Sealsle 2000’取材自大学草坪草种资源圃。
1．2 试验方法
1．2．1 材料培养
剪取下两节海滨雀稗匍匐茎，穿过海绵团固定在打有孔的泡沫板上，每个泡沫板种植24株，将泡沫板悬浮在1/2 Hoagland营养液培养三周，1/2的霍格兰营养液配方：2.5 mM Ca(NO3)2•4H2O, 2.5 mM KNO3, 1 mM MgSO4•7H2O, 0.5 mM KH2PO4, 46 μM H3BO3, 9 μM MnCl2•4H2O, 0.8 μM ZnSO4•7H2O, 0.1 μM H2MoO4•H2O, 0.3 μM CuSO4•5H2O, 和 20 μM FeEDTA。营养液每7天更换一次。材料生长一致后，分别进行以下五种处理：300 mM NaCl盐处理；4℃低温处理；20% PEG 6000处理；300 μM CdCl2 处理；币斑病病原菌侵染处理。盐处理、PEG处理、氯化镉处理和币斑病病原菌侵染处理的光周期为白天/夜晚：15小时/9小时，白天光照强度为200 μmol m−2 s−1，夜晚无光照。白天的温度设置为30℃，晚上的温度设置为25℃，湿度保持为60%，二氧化碳浓度为400 ppm。低温处理时光周期和其它处理一样，白天光照强度为50 μmol m−2 s−1，夜晚无光照。白天和夜晚的温度为4℃，湿度保持为60%，二氧化碳浓度为400 ppm。每个处理3个生物学重复，分别在处理0，1，3，12，24 小时剪取植物根系和叶片，迅速液氮保存，用于植物总RNA的提取。
1．2．2提取样品总RNA
采用OMEGA公司的Total RNA Kit I提取海滨雀稗叶片和根系的总RNA。用1%的Agarose凝胶电泳上检测RNA质量，并用TECAN酶标仪的NanoQuant 微量检测板测定RNA的浓度和纯度。将符合要求的总RNA于80℃保存备用。
1．2．3海滨雀稗WRKY家族基因全长的克隆与系统进化析
根据GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)已录入的海滨雀稗转录组数据分析筛选，共得到了29条WRKY家族基因序列，最终选取13个基因，其中6个基因只有中间片段，根据这6个基因的中间片段序列，利用Primer Primer 5.0软件设计特异引物（表1），采用RACE技术进行6个基因全长序列的克隆。以提取的总RNA为模板，利用TaKaRa公司反转录试剂盒合成第一链cDNA。PCR反应程序为：94℃ 1 min；34循环（94℃ 30 sec，58℃ 30 sec 72℃ 2 min）。将PCR产物进行1% Agarose凝胶电泳检测，切取目的条带，利用凝胶纯化试剂盒(北京天根生化)进行回收，并将回收片段连入T载体(pMD19T，TAKARA)，转化大肠杆菌DH10B，随机挑取阳性菌株进行PCR鉴定，将阳性菌液送交南京思普金生物科技有限公司测序。将测得序列与已获得的对应基因中间片段进行拼接比对分析。再将海滨雀稗13个WRKY家族基因全长序列进行系统进化分析。

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