紫花苜蓿作为我国栽培最为广泛的优质豆科牧草,具有适应性广、产量高、营养价值丰富、土壤固氮等优点，在草牧业发展和草地生态建设中发挥重要作用。我国紫花苜蓿的种植地区以西北、华北、东北为主，其中以西北甘肃省种植面积为最大，然而西北地区气候干旱、降雨量少，极大影响了紫花苜蓿的生长发育，因此，深入解析紫花苜蓿的耐干旱机理，加速其耐旱新品种的培育利用，对于解决这些地区干旱影响紫花苜蓿生长的问题具有举足轻重的意义。本研究以解析紫花苜蓿的耐旱分子机制为出发点，以适宜在甘肃河西地区推广种植的紫花苜蓿品种‘公农2号’为材料，构建cDNA表达文库，采用FOX 酵母筛选体系挖掘其耐旱基因，为紫花苜蓿的分子设计育种提供依据。
目录
摘要 1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法4
1.1材料4
1.2方法4
1.2.1 海滨雀稗全长cDNA表达文库构建 4
1.2.2表达文库的酵母转化获得抗旱基因4
2结果与分析5
2.1紫花苜蓿总RNA及mRNA纯化检测 5
2.2紫花苜蓿入门文库及表达文库的质量检测5
2.3文库质粒的酵母转化及抗旱基因的筛选6
3讨论与结论 8
3.1 cDNA文库构建和酵母筛选8
3.2 抗旱候选基因的功能分析8
3.2.1 GRAS 家族转录因子（DT1）8
3.2.2 乙烯响应因子（DT3）8
3.2.3 E3泛素化连接酶（DT10）8
3.2.4 其他蛋白9
致谢10
参考文献11
紫花苜蓿抗旱基因的挖掘及表达特性分析
引言
引言：紫花苜蓿作为我国以及世界上栽培最为广泛的优质豆科类牧草，具有适应性强、产量高、营养价值丰富、土壤固氮等优点，在草牧业发展和草地生态建设中发挥了重要作用。我国紫花苜蓿的主要种植地区为西北、华北、东北等地，其中以西北甘肃省种植面积最大，甘肃省地处黄河上游，地域较为广阔，地形比较复杂，同时草原面积辽阔，拥有悠久的紫花苜蓿种植历史与较为成 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
熟的紫花苜蓿种植技术，因此发展苜蓿产业是保护当地生态环境和提高生产效益的重要途径，并且截至2013年统计产量已达到1120万亩[1]。然而，西北地区的气候条件不容乐观，由于气候干旱、降雨量少，极大影响了紫花苜蓿的生长发育，因此极易降低其产量及品质。干旱不仅是我国更是全世界农业生产都需要面对的重大挑战，而我国更应当积极面对，解决这一生产威胁。同时我国畜牧业在近40年来发展非常迅速，畜牧产业消耗的饲料与粮食生产所争夺耕地的矛盾日趋紧张，而为了解决这一矛盾，开发部分干旱地区及盐碱地种植耐旱耐盐碱性牧草，即能保证畜牧产业发展所需牧草水平，同时不与农民粮食生产争夺耕地，也能为农户提高创收，是未来急待发展和解决的主要问题。因此，在基因层面上深入解析豆科牧草紫花苜蓿的耐干旱机理，同时加速紫花苜蓿耐旱新品种的培育与利用，对于解决这些地区由于干旱而影响紫花苜蓿生长的问题以及扩大紫花苜蓿种植范围与提高紫花苜蓿生产力，具有举足轻重的科学意义[2]。
近些年来，在紫花苜蓿耐旱资源评价及耐旱机制研究方面已经取得了一定的进展。尤其是在发掘紫花苜蓿抗旱基因方面，许多研究学者取得重大进展，例如聂利珍，刘红葵等通过转AmDHN基因研究紫花苜蓿耐旱性，其研究表明，在干旱胁迫条件下，由于AmDHN基因在紫花苜蓿中的过量表达,使得植株体内脯氨酸的大量累计，从而进一步诱导相关基因合成脯氨酸,最终引起转基因紫花苜蓿植株抗旱性能的提高[3]。除此之外，段珍通过研究无芒隐子草LEA2/ALDH12A1基因和Bar基因共同转化的豆科牧草紫花苜蓿，并进行实验分析发现干旱胁迫都可以诱导CsLEA2基因在紫花苜蓿叶中的大量表达，并且在干旱条件下表达量超过对照植株的4倍以上；而CsALDH12A1基因是对照组的6倍以上，这些研究都很好地表明了CsLEA2基因和CsALDH12A1基因的超表达使转基因植株具备更好的耐旱性能[4]。
同时通过研究发现，不同豆科牧草紫花苜蓿的品种对干旱胁迫的适应性及耐性呈现显著差异，其中抗氧化能力、渗透调节、内源激素水平、光合作用与紫花苜蓿的耐旱性能密切相关[5]。通过检测干旱胁迫条件下渗透调节物质的变化，发现脯氨酸含量的多少及增加的幅度水平能够反映出紫花苜蓿的耐旱性。干旱诱导紫花苜蓿叶片中ABA含量提高，因此耐旱性强的紫花苜蓿品种能在较长时间内维持更高的ABA水平。除此之外，外源性水杨酸亦显著提高了紫花苜蓿的耐旱性[6]。然而，目前关于紫花苜蓿耐旱性的研究大多集中在生理层次，而关于其耐旱分子机制的研究数量尚少[7]。
目前，采用转基因手段改良豆科牧草紫花苜蓿的耐旱性能已经取得了一定的成果，如旱生植物霸王的ZxNHX和ZxVPI1 [8]、沙漠植物无芒隐子草CsLEA和CsALDH[9]以及大豆GsZFP1 [10]转化紫花苜蓿均较为显著地提高了耐旱性。这些已近成功转化的优质耐旱基因都来源于其他植物，而来自紫花苜蓿自身的耐旱基因开发尚为稀少，仅出现NAC转录因子[11]、MsGME(GDP甘露糖3´，5´异构酶) 、MsZIP [12]等部分少数耐旱基因的报道，极大程度地限制了紫花苜蓿自身耐旱机制的解析。同时，基于当前最热门的基因组编辑技术CRISPRCas9，进行系统挖掘材料自身的优质基因并进行人为改造将成为未来的植物分子遗传改良的重要方向。由此，进行豆科牧草紫花苜蓿耐旱基因的系统挖掘以及对其耐旱分子机制解析及耐旱分子遗传改良都至关重要。
近些年来，植物耐旱基因的挖掘方法主要采用正向遗传学（性状到基因，如基因组高通量测序、图位克隆等）和反向遗传学（基因到性状、转录组测序、蛋白组分析）等[13]。正向遗传学方法成本较高、周期较长，仅适用于模式植物或部分重要作物；反向遗传学方法数据量较大，无法高效捕获到RNA转录有无变化，翻译后修饰产生功能的蛋白基因[14]。FOX捕捉系统（Fulllength cDNA Overexpressing gene hunting system）作为一种功能获得性基因筛选技术，具备高效、经济、无物种限制、易操作等优势[15]，可用于系统阐明植物基因的功能，而且通过在模式植物拟南芥或酵母细胞中过量表达目标植物的全长cDNA文库，并获得含有不同cDNA插入的拟南芥库或转基因酵母，根据这些已经表达的全长cDNA导致的显著突变表型获得目标试验植物的cDNA基因功能[16]。此方法采用了正向遗传学的思路以及反向遗传学的手段，特别适合应用在背景复杂、、并且转化效率较低而世代较长的植物中，在较短时间内解析基因功能不仅大大缩短了研究周期，同时此种方法也为探索植物新的功能基因奠定了一定基础。

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