梨PbrLCL1基因是LCL基因家族的成员，其表达具有显著的周期节律现象。前期研究表明，PbrLCL1基因可能参与成花过程调控。本试验对MYB类转录因子PbrLCL1的生物学功能进行验证，使用农杆菌介导法，将空载载体pCAMBIA1300-35S:GFP和pCAMBIA1300-35S:PbrLCL1-GFP的表达载体转入野生型本生烟中。以空载型烟草作为对照，筛选并获得PbrLCL1的转基因阳性植株，并以该转基因材料分析PbrLCL1基因在长日照培养条件下调控花期方面的功能。在长日照培养条件下，梨PbrLCL1基因在本生烟植株内过量表达可促使花期提前，转基因烟草植株的叶片数显著少于空载对照，而植株高度并未发生明显变化。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 实验材料2
1.1 植物材料 2
1.2 生化试剂 2
1.3 主要使用的溶液和培养基2
2 实验方法2
2.1 无菌本生烟的培养2
2.2 本生烟的遗传转化方法3
2.3 CTAB法提取烟草叶片总核酸及PCR鉴定3
2.3.1 CTAB法提取转基因烟草叶片总核酸3
2.3.2 PCR扩增反应鉴定转基因阳性苗 3
2.4 转基因烟草RNA的提取、RNA反转录cDNA反应及PCR鉴定4
2.4.1 转基因烟草RNA的提取4
2.4.2 转基因烟草RNA反转录cDNA反应5
2.4.3 PCR扩增反应鉴定转基因阳性苗（RTPCR）6
2.5 转基因烟草种子的筛选以及纯合子的获取6
2.6 转基因阳性烟草植株的开花表型统计以及形态参数测量6
3 结果与分析6
3.1 梨PbrLCL1基因本生烟植株的阳性鉴定6
3.2 梨PbrLCL1转基因阳性植株的表型分析7
3.2.1 转基因阳性植株的开花时间表型分析7
3.2.2 转基因阳性植株的形态学指标分析7< *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
br /> 4 讨论9
致谢9
参考文献9
梨成花相关MYB转录因子的功能验证
引言
梨是我国一种重要的大宗水果，其面积和产量均位居世界首位。梨成花是果实形成的基础，因此阐明梨成花调控的分子机制，对于调控花期、提高产量和品质具有重要的理论和实践意义[1,2]。近年来，果树成花研究取得了较大的进展[3]。但是对于涉及果树成花的众多基因功能尚不清楚。研究表明，植物的生物钟(Circadian Clock)系统参与成花过程调控。
近年来在果树中克隆了一些成花相关基因，例如FLC、FT、SVP、ELF5、TFL等基因[46]。目前针对开花信号整合因子FT的研究较多，已经在梨[5]、苹果[7]、柑橘[8]、葡萄[9]、荔枝[10]等果树上分离到了FT基因。在苹果[11]、李[12]、梨[13]等蔷薇科果树中利用转基因方法使FT基因过表达可以促使植株成花。这表明蔷薇科果树的成花调控途径有高度的保守性，FT的表达调控机制可能是决定成花的重要因素。然而目前梨树中的研究多局限于FT等成花相关基因的克隆和功能验证，调控梨成花基因表达的上游信号分子尚不明确。
在模式植物中MYB类转录因子如LHY和CCA1等生物钟组分通过多重途径参与成花调控[14]。但迄今为止，木本多年生梨树中生物钟基因的功能及其在不同品系中的多态性对于梨成花过程的影响还未有研究。
在梨中，课题组前期的研究发现了与LHY和CCA1同源的LHYCCA1 LIKE (LCL) 基因家族，其成员的表达有显著的周期节律现象。其中PbrLCL1与LHY和CCA1的同源性较高，节律稳定且表达水平较高，PbrLCL1蛋白N端都存在有DNA结合能力的MYB保守结构域。因此PbrLCL1可能直接或间接调控FT等成花基因的表达，参与成花过程调控，但是其功能需要进一步的实验验证。
梨的遗传转化体系尚不成熟，且从梨组培苗到开花需要数年的时间，因此多采用异源表达的方式进行基因功能验证。本生烟（Nicotiana benthamiana）是一种常用的模式植物，其植株较小，培养周期仅需23个月，且易于遗传转化，是一种较为理想的实验材料[15]。
1 实验材料
1．1 植物材料
本试验以野生型本生烟(Nicotiana benthamiana)为试材，本生烟种子由大学梨工程研究中心提供。
1．2 生化试剂
农杆菌GV3101、MES、乙酰丁香酮、潮霉素、羧苄青霉素、特美汀、头孢霉素、卡那霉素、DNA提取的相关试剂、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、Taq酶、pCAMBIA130035S:GFP载体、dNTPs、PCR正反引物、MgCl2等无机盐及有机试剂。
1．3 主要使用的溶液和培养基
6BA、NAA、IBA、LB液体培养基、MS 液（固）体培养基、烟草种子培养基(1/2MS培养基)、烟草继代培养基、烟草共培养培养基、烟草筛选培养基、生根培养基等。
2 实验方法
2．1 无菌本生烟的培养
整个播种操作在超净工作台上完成。准备好75% 乙醇溶液，10% 次氯酸钠溶液，无菌水，1000μL移液枪，灭菌枪头以及待清洗的本生烟种子（装在1.5mL离心管中）。
用75% 乙醇溶液洗种1分钟，可轻轻晃动离心管，保证充分清洗种子。再用无菌水彻底清洗3遍。
用10% 次氯酸钠溶液洗种35分钟，可轻轻晃动离心管，保证充分清洗种子。再用无菌水彻底清洗5遍。
将彻底清洗好的种子均匀地播撒至1/2 MS 固体培养基上（使用培养瓶装固体培养基），盖好盖子。在4℃避光条件下放置2天。注意：可将枪头顶端剪去一小部分，方便吸取种子和均匀地铺撒种子。当种子均匀散布在培养基表面后，将培养基表面的无菌水吸取干净。

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