【目的】目前，对葡萄谷胱甘肽抗氧化系统相关基因在转录水平应答盐胁迫机制的研究尚属空白，本实验旨在弥补这一空白，为进一步探究葡萄抗盐机制提供理论依据。【方法】采用转录组测序从全基因组水平分析葡萄对盐胁迫响应相关的基因表达与调控的分子机制，筛选得到差异表达基因，用PlantCARE软件对其启动子进行序列分析，同时使用多种在线分析软件对蛋白结构域及功能进行预测，最后再通过实时荧光定量PCR技术，对不同浓度、不同时期盐胁迫下采得的葡萄样品进行相对定量分析，验证其表达差异情况。【结果】转录组测序共获得2473个差异表达基因，其中上调基因1067个（43.15%），下调基因1406个（56.85%），从中筛选出8个谷胱甘肽抗氧化系统相关基因，包括GR、APX-2、GRX-1、GRX-2、GST-2、GST-5、GST-9和Trx-1。启动子序列分析发现其含有丰富的胁迫相关元件，蛋白结构域预测发现其均含有抗氧化相关结构域。实时荧光定量PCR技术检测结果显示，盐胁迫盐胁迫下8个基因表达量均有明显变化，且均为正向调控基因，其中6个基因主要在6h时应答盐胁迫，表达量随时间表现出钟形曲线，两个基因在6h和48h时两次大幅上调，呈现倒S型曲线。【结论】葡萄谷胱甘肽抗氧化系统相关基因在转录水平上参与盐胁迫调控，其响应模式与胁迫时间及浓度有关。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1 转录组测序2
1.2.2 启动子上的作用元件预测2
1.2.3 蛋白结构域分析2
1.2.4 引物设计2
1.2.5 总RNA提取3
1.2.6 cDNA反转录3
1.2.7 8个相关基因及内参基因的PCR扩增3
1.2.8 实时荧光定量RCR3
结果3
2.1 葡萄盐胁迫下的转录组数据分析3
2.2 启动子序列分析4
2.3 蛋白结构域预测5
2.4 葡萄谷胱甘肽抗氧化系统相关基因在盐胁迫下的表达分析6
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2.4.1 实时荧光定量RCR产物特异性6
2.4.2 葡萄谷胱甘肽抗氧化系统相关基因在不同浓度盐胁迫下的表达特性6
2.4.3 葡萄谷胱甘肽抗氧化系统相关基因在盐胁迫不同时期的表达特性7
3 讨论 8
致谢8
参考文献8
图1 谷胱甘肽抗氧化系统响应盐胁迫的表达变化情况8
图2 实时荧光定量PCR熔解曲线6
图3 8个相关基因在盐胁迫下的相对表达差异8
表1 引物序列及用途3
表2 启动子元件5
表3 蛋白结构域6
葡萄谷胱甘肽抗氧化系统相关基因响应盐胁迫的机制分析
引言
随着土壤盐渍化程度日益加重，盐碱土地面积日益扩大，盐胁迫已成为制约园艺作物生产的主要逆境因素之一[1]。过量的盐会引起叶斑、落叶、枯枝甚至树体死亡，同时也影响园艺作物产量和品质。果树因自身遗传特性的不同，耐盐性存在着明显差异，葡萄比其他果树能更好地适应盐渍相当强的土壤，并且在后代中保持对地下水盐渍化的高度适应性，在盐土栽培中的发展前景十分广阔，因此对葡萄响应盐胁迫机制的研究也就显得至关重要[2]。
盐胁迫对植物的影响有大部分来自于其导致的活性氧自由基的大量产生[4]，这些活性氧自由基如不能及时被清除便会使细胞氧化受损甚至导致细胞死亡。而植物不能移动以躲避盐胁迫的影响[3] ，它们进化出一套完整的抗氧化机制以抵御可能发生的氧化胁迫压力[5]，谷胱甘肽抗氧化系统是此机制重要的组成部分[6]，以往的研究已经发现，植物谷胱甘肽抗氧化系统主要通过抗坏血酸谷胱甘肽循环，GPx循环以及有机酸途径清除活性氧自由基，涉及的主要酶有抗坏血酸过氧化物酶（APX）、单脱氢抗坏血酸还原酶（MDAR）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽巯基转移酶（GST）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷氧还蛋白（GRX）、抗氧化蛋白家族（PRX）以及谷胱甘肽合成酶（GS）。这些酶相关基因可能在转录水平上参与植物响应盐胁迫的调控，但对其具体调控机制的研究尚不充分，对葡萄谷胱甘肽抗氧化系统相关基因响应盐胁迫的分子机理研究尚属空白，本实验旨在弥补这一空白。实验首先通过转录组分析筛选出可能具有重要调控作用的基因GR、APX2、GRX1、GRX2、Trx1、GST2、GST5和GST9，它们在盐胁迫下表现出明显的表达差异。在转录水平的调控中，启动子的作用十分关键[7]，因此实验进一步利用生物信息学分析软件对相关基因启动子上的顺式元件进行分析，了解高保守顺式元件与相关基因表达调控的相关性，同时通过实时荧光定量PCR技术检测在不同浓度盐胁迫的各个时期基因表达量的变化情况，详细分析了盐胁迫如何调控基因的表达，为后续谷胱甘肽抗氧化系统相关基因表达调控的研究提供了依据。
1 材料与方法
1．1 材料
参照邢庆振[9]等的方案设置盐浓度梯度，对四组巨峰葡萄盆栽幼苗进行0、0.1%、0.2%、0.3%的NaCl溶液浇灌，并分别于0h、6h、12h、24h、48h采样，液氮冷冻后40℃保存。
1．2 方法
1．2．1 转录组测序
Illumina HiseqTM2500进行测序。文库的构建、测序及数据分析工作由上海瀚宇生物科技有限公司完成。筛选得到葡萄谷胱甘肽抗氧化系统中8个在盐胁迫下差异表达明显的基因。
1．2．2 启动子的上的顺式作用元件预测
通过Phytozome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)BLAST基因序列，得到8个相关基因编号及在染色体上的位置，以基因上游1500bp为启动子区域，再通过Grape genome browser得到启动子序列。最后利用Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行启动子上的元件分析[6]。
1．2．3 蛋白结构域分析
使用BioXM软件翻译蛋白序列，通过SMART网站（http://smart.emblheidelberg.de/）进行蛋白结构域分析。
1．2．4 引物设计
使用NCBI进行在线引物设计（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ），分别得到克隆引物和定量引物。通过PCR扩增技术检测引物有效性。引物序列在表1中列出。
1．2．5 总RNA提取
分别取取液氮冷冻后40℃保存的样品，采用CATB法获取消化DNA的总RNA。
1．2．6 cDNA反转录
分别取20个样本的1.5µg消化DNA的总RNA，加入1µg的反转录引物P1 和P2，再分别加入4µL 5×RT buffer，1µL 10 mM dNTP Mixture，1µL RNase Inhibitor（40U/µL），1µL DTT（20mM），1µL SuperScriptⅢ（200U/µL），加DEPC水到总体积20µL。充分混匀后，瞬时离心，50℃保温45min；70℃保温10min。置于冰上冷却，置于40℃保存备用。

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