piggybac转座子在二化螟胚胎中的剪切和转座活性检测
目录
摘 要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引 言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料2
1.2 主要试剂和仪器设备2
1.3 载体准备3
1.4 昆虫卵显微注射3
1.5 卵中质粒DNA的提取3
1.6 电击转化3
1.7 剪切活性检测4
1.8 转座活性检测4
2 结果与分析4
2.1二化螟胚胎中piggyBac转座子剪切活性检测4
2.2二化螟胚胎中piggyBac转座子转座活性检测5
3 讨论6
致 谢7
参考文献7
piggyBac转座子在二化螟胚胎中的剪切和转座活性检测
引言
二化螟Chilo suppressalis属鳞翅目螟蛾科，是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一， 使水稻在分蘖期造成枯鞘，枯心苗，在穗期造成虫伤株和白穗。 二化螟的危害在一般年份使水稻减产3%5%，严重时减产30%以上。二化螟在国内各稻区均有分布，较三化螟和大螟分布广，但主要以长江流域及以南稻区发生较重。解放初期，我国水稻种植制度是单季或间作，大部分螟害以二化螟为主。20世纪50年代至70年代中期二化螟发生较轻。70年代末，我国长江流域等稻区因改制和大面积推广种植杂交稻，二化螟发生与危害曾明显上升。进入80年代后，二化螟迅速回升。90年代以来，由于气温升高，耕作制度改变，品种优化、杂交化和推广高产轻型栽培措
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施以及人工防治水平下降等原因，二化螟和三化螟连年暴发成灾，其中二化螟灾害尤为严重，二化螟种群数量在我国长江中下游和江浙沿海稻区明显回升，危害加重，对水稻高产稳产构成严重威胁。与此同时，由于栽培技术的改变、杂交水稻的大力推广及南北方水稻品种的互相交换，二化螟在华北和东北地区的危害从零星发生到逐渐加重，呈上升趋势，这种趋势更有继续蔓延扩展的势头，已经成为制约水稻生产的重要害虫(姜卫华，2011)。长期以来，对二化螟的防治主要采取见效快、防效好的药剂防治。然而，我国的水稻螟虫防控过度依赖药剂防治会导致抗药性和环境污染等问题的发生。因此，水稻螟虫防控必须开发高新技术，作为二化螟防治的技术储备。
自从 1982 年首例转基因果蝇获得成功以来，转基因昆虫的研究便引起了科学家们极大的兴趣。转基因昆虫也被应用于害虫防治：即不育昆虫技术(sterileinsect technique, SIT)，所谓SIT, 就是通过转基因技术制造不育昆虫，并使昆虫的不育成员充满一个害虫种群, 导致大多数昆虫交配不能产生正常发育的后代, 而有害基因又可以通过少数有效的交配继续向后代转播。因此，当昆虫不育技术与昆虫转基因技术相结合, 农业害虫防治有了新的方向。
因此，实现SIT技术的前提是要有成熟的昆虫转基因工具。目前，转基因昆虫普遍采用的转化工具是DNA转座子。这些DNA转座子包括有：果蝇的P 因子，Tc1/Mariner家族的Minos，hAT家族的Hermes，Mariner家族的Mos1和piggyBac家族的IFP2。 其中piggyBac 家族的IFP2因子，不但能够在生物染色体中精确地剪切和转座，而且具有广泛的适用范围，在双翅目，鳞翅目，鞘翅目，半翅目和膜翅目五个目的几十种昆虫以及真涡虫，疟原虫，人和小鼠的哺乳动物细胞体内实现了高效地转化(Handler., 2002; Robinson, 2004; Allen, 2004; Shinmyo, 2004; Lobo et al., 2006; Morales et al., 2007; Wilson et al., 2007; Luo et al.,2011; Ferguson et al.,2011;Wang et al.,2010 ; Daimon et al., 2010)。
鉴于piggyBac转座子在多种生物寄主中转化活性，本研究拟尝试在二化螟胚胎采用二元和三元转化系统，通过显微注射的方法检测piggyBac转座子在二化螟胚胎中的剪切和转座活性，探讨在二化螟中应用piggyBac转座子实现转基因目标的可行性，为进一步在二化螟中开发转基因技术实现害虫防治奠定基础。
1 材料与方法
1．1 实验材料
实验中所选用的昆虫有二化螟和果蝇。
1．2 主要试剂和仪器设备
主要试剂：
pGEMTeasy载体、T4 DNA 连接酶、BglII限制性核酸内切酶、普通Taq酶和DH5α电转感受态细胞；常规试剂盒有：质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒和无内毒素质粒抽提试剂盒等。
主要仪器设备：
凝胶成像系统Gel Doc2000：美国BioRad公司；
超纯水系统E1IX10：美国Millipore公司；
Sorvall Legend Micro 21R离心机：美国Thermo Fisher公司；
离心机Centrifuge 5145D：德国Eppendorf 公司；
烘箱MC000712：德国MMM公司；
高压灭菌锅SS325：日本TOMY公司；
PTC200热循环仪：美国MJ Research公司；
A2型生物安全柜1285，美国Thermo Electron公司；
恒温金属浴：杭州博日科技有限公司；
显微注射系统：德国Eppendorf 公司；
电转化仪: 美国BTX公司。
1.3 载体准备
Helper质粒pBacHsp、Donor 质粒pB[KOα]和Taget质粒由加州大学河边分校T.A.Miller 教授赠送。质粒DNA都用Qiagen公司的无内毒素质粒抽提试剂盒提取，并于20°C保存备用。
1.4昆虫卵显微注射
配置剪切显微注射液
5×Injection Buffer 4 µl
Helper 载体 终浓度0.4 µg/µl
Donor 载体 终浓度0.6 µg/µl
ddH2O up to 20µl
（1）显微注射液为现配现用，配好以后12000rpm，离心10min，吸取上清至一新管。
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