摘要：尽管菊酯类杀虫剂抗性在小菜蛾中广泛存在，但对其所有抗性相关突变位点进行同时检测尚未见报道。本文调查了我国华东和华南地区小菜蛾的高效氯氰菊酯抗性，发现抗性水平介于4-680倍之间且呈现区域性特征；检测了小菜蛾中已报道的与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性相关的七个突变位点的等位基因突变频率，发现钠离子通道L1014F和T929I位点的突变频率均已接近100%，A1060T的突变频率为68%-100%，P1836S的突变频率为93%-100%，M918I的突变频率较低，在0%-17%之间，所有检测种群未发现F1020S和M918T突变。研究结果显示高水平抗性或与高频率的等位基因突变有关，同时中低水平抗性的种群也具备较高的突变频率，菊酯类杀虫剂的使用应当受到限制。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1供试昆虫 2
1.2供试药剂 2
1.3.室内毒力测定方法2
1.4小菜蛾 DNA 的提取2
1.5 DNA 测序法 3
1.5.1引物设计3
1.5.2突变位点的检测3
1.6数据统计3
2结果与分析3
2.1田间小菜蛾对高效氯氰菊酯的抗性测定结果与分析 3
2.2田间种群钠离子通道基因突变检测结果与分析 5
2.2.1引物设计5
2.2.2 PCR产物的测序分析 5
2.2.3抗性基因频率检测 7
3讨论7
3.1小菜蛾对高效氯氰菊酯抗性 7
3.2小菜蛾钠离子通道突变与拟除虫菊酯抗药性 8
4结论9
致谢9参考文献 10
田间小菜蛾对高效氯氰菊酯的抗性及其钠离子通道基因突变频率检测
引言
小菜蛾Plutella xylostella（Lepidoptera:Yponomeutidae）属于鳞翅目菜蛾科，是世界范围内的一种重要害虫，每年造成的经济损失达40~50亿美元。我国自20世纪70年代使用拟除虫菊酯类杀虫剂
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,田间多个害虫已对其产生了较强的抗药性。小菜蛾生活周期短、繁殖能力强、世代重叠严重及田间不合理用药，使之几乎对所有的防控用药产生了不同程度的抗性，给十字花科蔬菜生产带来严重威胁和巨大挑战。杀虫剂的广泛使用使得害虫抗药性问题日益突出，点突变所产生的杀虫剂靶标分子的结构变化是昆虫对杀虫剂产生抗性的重要机制之一。根据其功能,钠离子通道可分为3部分：①选择性滤器(selectivity filter),位于细胞外膜,允许适当大小和适当电荷的离子通过,钠离子有高度的选择性,最易通过；②电压传感器(voltagesensor),位于内、外膜之间,对膜电位变化敏感,可控制闸门的开关；③闸门,位于内膜,为通道的内侧口,当膜上带电粒子作电荷运动时引起一个电压依赖性变化,因此在Na+通透之前的瞬间,产生微弱的门控电流或门电流(gating current),其大小约为钠电流的0.3%[1]。随着分子生物学技术和方法在害虫抗性研究中的应用, 可以推断, 还有一些以前认为是解毒代谢增强的拟除虫菊酯类杀虫剂代谢抗性, 事实上主要是Kdr 型抗性, 如长期以来一直认为桃蚜对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性机制是杀虫剂解毒酯酶E4和FE4的扩增[2]。最近的研究表明,几个具有E4酯酶扩增的桃蚜品系对拟除虫菊酯类杀虫剂和 DDT 的抗性主要与钠离子通道的氨基酸突变相关[3]。目前关于昆虫钠离子通道与抗药性的研究主要集中于拟除虫菊酯类杀虫剂抗性昆虫的击倒抗性(knockdown resistance)。另一方面，钠离子通道在害虫抗药性中的重要作用也推动了昆虫钠离子通道的研究。击倒抗性Kdr是指昆虫对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂的快速麻痹的表现抗性，首个Kdr抗性位点L1014F在家蝇钠离子通道α亚基中发现。遗传学实验表明此隐性遗传的抗性基因位于家蝇第III染色体上。家蝇superkdr突变M918T仅在骚扰角蝇中检测到，并再一次发现M918T与L1014F突变组合时呈现高抗性[4]。在小菜蛾中报道了第2个superkdr突变T929I，该突变位于ⅡS5片段的起始部位[5]。Tsukahara等(2003)研究结果表明，L1014F与T929I突变相关且参与了小菜蛾对氰戊菊酯的抗性，尽管在未经药剂筛选的品系中也存在较低频率的突变。
本课题旨在调查我国华东和华南地区的小菜蛾对高效氯氰菊酯的抗性现状，掌握小菜蛾对该杀虫剂的抗性水平，为田间合理用药提供依据；同时检测拟除虫菊酯类抗性相关的钠离子通道基因突变频率，以期明确靶标突变与拟除虫菊酯抗性的关系。
1.材料与方法
1.1供试昆虫
室内敏感品系Roth，由英国洛桑实验站惠赠，在室内不接触任何药剂环境中饲养20年以上。
田间种群，采于我国华东及华南地区的8个地方。
华东地区:南京、昆山、合肥、济南；华南地区：广州、增城、惠州、深圳。
1.2供试药剂
19.16%的高效氯氰菊酯EC；
昆虫 DNA 提取试剂盒，Omega公司
1.3室内毒力测定方法
参照Shelton等(1993)的浸液法。取用洁净的甘蓝(Brassica oleracea)叶，制成直径6.5cm的圆片。设置57个药剂浓度，并以清水（含0.1%Triton100）作空白对照，每个浓度4次重复，每个重复处理10头试虫。将叶片在药液中浸泡10秒后取出晾干，将晾干的叶片垫在直径6.5cm的培养皿中，并接入10头三龄中期试虫。处理后试虫的饲养条件：温度25±1℃，相对湿度6570%，光照比(L：D)16：8。处理120h后查结果，以毛笔轻轻触动虫体，不能协调前进的视为死亡。对照组死亡率超过10%则舍去此组结果。用POLO软件计算毒力回归方程的斜率(slope)、标准误、LC50 值及其95%置信限。
1.4小菜蛾 DNA 的提取
取单头4龄小菜蛾置于灭菌过的2 mL离心管内，加液氮，置于冰上，用灭菌的铁杵将其捣碎，分别加入各试剂进行总DNA提取，提取步骤如下：
(1)加入350μL Buffer CTL和25μL Proteinase K于60℃ 水浴锅中30min;
(2)加入350μL比例为24:1的氯仿:异戊醇 24:1，104g离心 5min;
(3)取出250μL上清移至新的离心管中，加入250μL Buffer CBL于60℃水浴锅中10min;
(4)加入250μL 无水乙醇，漩涡振荡15s，混匀;
(5)将液体加入HiBind DNA柱形管，104g离心2min;
(6)弃上清液，加入500μL Buffer HB，104g 离心1min;
(7)柱形管移至新的收集管，加入700μL DNA Wash Buffer，104g离心1min;

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