水稻卷曲度作为重要的农艺性状之一，在改善株型上发挥着重要的作用。在农业生产中，合适的叶片卷曲度不仅可以改善自身受光姿态，还能优化群体结构，提高群体光合作用效率，达到增产增收的效果，因此对于水稻叶片的卷曲性状进行遗传学相关研究具有重要的实际意义。本实验室前期从粳稻品种Asominori（Aso）的60Co-γ射线辐射诱变突变体库中获得了一份稳定遗传的卷叶突变体材料，暂时命名为rl17(t)（rolled leaf 17）。除叶片呈现内卷外，rl17(t)较野生型Aso还表现出株高矮化，粒重与结实率均显著下降。以rl17(t)为母本与WT进行杂交，F1植株均表现为叶片平展，且F2群体中叶片平展型和叶片卷曲型单株数目符合3:1分离，说明突变体中叶片卷曲表型由隐性单基因控制。我们利用rl17(t)与籼稻品种IR24的F2分离群体开展功能基因的图位克隆。初定位时，对分离群体中20个极端叶片卷曲的单株进行全基因组基因型鉴定，将候选基因限定在第9染色体上分子标记DF53和NJ9-5之间，物理距离为2.43Mb。随后，在候选区域内进一步加密标记，结合交换单株的基因型和表型，最终将候选基因缩小至580kb的区段内，其间暂无已报道的基因。本研究工作为后续卷叶基因的克隆与功能研究奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1材料与方法5
1.1试验材料和生长条件5
1.2方法 5
1.2.1表型鉴定5
1.2.2 遗传分析和定位群体构建5
1.2.3卷叶基因定位 5
2结果7
2.1 rl17(t)与野生型农艺性状的比较7
2.2 突变体表型的遗传分析8
2.3基因初连锁与精细定位8
3讨论 9
致谢9
参考文献10
水稻卷叶突变体rl17(t)的遗传分析与功能基因定位
引言
引言：叶片作为重要的光合作用器官，源于种子植物茎间分生组织旁侧区域的侧向器官，沿着水稻茎近轴和远轴展现出极性发育特性[1,2]。理想化的叶片结构对于水稻群体最大化的光能捕获
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和气体交换尤为重要[3,4]，杂交水稻之父袁隆平就曾提出超高产稻株形态模式特点之一为叶片向内微卷,较窄,展开宽度约2cm[5]。因此通过调控水稻卷曲度来改善水稻群体结构，从而提高光合作用效率,最终实现作物增产增收的目标,对农业生产有着非常重要的意义。
早期对叶片的研究发现，单子叶植物（除了沼生目）在叶片近轴端表面维管束之间有着有高度液泡化的泡状细胞，参与叶片卷曲的调控[6]。干旱条件下，泡状细胞失去膨胀压，变得皱缩导致叶子发生卷曲。一旦水分足够了，泡状细胞便重新扩张，叶子张开[7]。然而，随着各个学科领域的发展，对卷叶的形成机制也有了更加深入的了解，植物叶片发生卷曲的主要原因主要可以归为植物生长的环境因素和自身内在遗传变异。环境因素包括非生物胁迫和生物胁迫两个方面，外界环境胁迫导致植物体内有机酸与离子浓度、水杨酸信号系统以及抗氧化系统的变化,使得植物产生一系列应激反应,表现出叶片卷曲的状态[8]。遗传方面,叶的发生和发育是一个复杂的过程,可大致分为三个步骤:叶的起始、叶的特征决定、组织的分化[9]。在这一过程中复杂的基因调控网络即便发生微小的突变都可能导致叶片的卷曲。
自然界中非生物胁迫主要包括缺水、高温、辐射、除草剂、重金属、臭氧等[10]，其中水分是导致水稻、玉米、小麦、高粱等大多数植物叶片发生卷曲最主要非生物胁迫之一。外界环境因素发生变化之后，受到胁迫的植物体会激发体内的信号分子响应。水杨酸(SA,salicylic acid)是植物中被识别的重要信号分子，参与植物光合作用、酶的活性、开花习性、离子吸收等一系列植物体的生长与发育过程的调控[11]。在银叶竹芋(Ctenanthesetosa)中,内源SA含量与卷叶成正相关;干旱胁迫时,外源SA通过诱导抗氧化系统活性进而延迟叶片卷曲[12]。有机酸与无机离子对渗透压的调节发挥重要的作用,无机离子特定条件下会进入液泡调节渗透压[13]。Gregorio和Senadhira认为水稻叶片卷曲是细胞壁离子累积的结果,因为在卷叶中外部的钠离子浓度太低而不能与水分亏缺造成的影响相抵[14]。Sagla等报道苹果酸和柠檬酸浓度增加导致叶片的卷曲[13]。此外，在植物的生长过程中,往往还面临着许多生物胁迫，比如昆虫的取食,病毒、细菌和真菌的侵染都可能导致叶片的卷曲。自然界中比较有趣的是一些昆虫比如稻纵卷叶螟、直纹稻弄蝶等会通过吐丝拉线将叶片的向对面或相邻叶片粘连起来,使叶片发生卷曲[15,16]，以达到避免寄生虫、天敌、恶劣天气的伤害。当水稻受到黄单胞杆菌属细菌侵染之后会感染细菌性条斑病,伴随病原体侵染范围扩展,叶片颜色由灰绿色到黄色,期间伴随着叶片的萎蔫和卷曲[17]，严重侵染的情况下可能造成重大的减产。
遗传学上对叶片卷曲的原因主要是从叶片极性发育异常、小RNA调控网络,以及基因突变等方面来解释。众所周知叶片前期就是一团分生组织细胞，后来由于基因选择性表达，分生组织细胞开始分化增殖，叶片也就形成了。为了精细的研究叶片的生长发育，人为的划定了叶原基的三个轴向的极性模式：近远轴(adaxialabaxial axis,从叶的上表皮指向下表皮,有时也称背腹轴)、中边轴(centrolateral axis,从叶的主脉指向边缘)以及基顶轴(proximodistal axis,由叶的基部指向尖部)。研究报道称在分生组织细胞中相关基因如果持续表达,就不会形成正常的叶片,因此相关家族基因表达的下调被认为是叶片发育起始的标志性事件[18]。KNOX蛋白在基顶轴发育过程中发挥其作用,而HDZIPIII、KANADI以及YAB在近远轴和中边轴发育中扮演了重要角色[1920]。在顶端分生组织分生的整个过程都检测到了KNOX(ClassIKnottedlLike Homeobox)基因的表达。在对玉米knotted1突变体[21]以及拟南芥STM突变体研究中发现[22],分生组织分裂增殖的功能出现不同程度的缺陷，这表明KNOX基因对于顶端分生组织的适当维持是不可或缺的。进一步的研究表明KNOX转录因子是调节赤霉素(gibberellin,GA)和细胞分裂素(cytokinin,CK)的直接前体，通过调控CK和GA含量来维持顶端分生组织的特性[23]。维持叶片近远轴正常发育的基因家族是HDZIPIII (Class III Homeodomain Leucing Zipper),它主要包括5个亚家族:PmBULOSA(PHB)、PHAVOLUTA(PHV)、REVOLUTA(REV)、ATHB8和ATHB15。研究HDZIP III家族基因的功能主要是从拟南芥phavolula(PHV)[24]、Phabulosa (PHB)、Revoluta(REV)[25]突变体以及玉米Rolkdl(rldl)[26]入手。其中PHB/PHV基因控制叶原基中近轴化细胞的命运,突变体的远轴面细胞近轴化,导致叶片内卷,而表型严重的突变体叶片呈现辐射状。与HDZIPIII基因相拮抗的是如KANADI(KAN)和YABBY(YAB)家族基因。KAN在叶原基的远轴面表达，KAN缺失突变体叶片近轴化,反之,KAN的过表达会引起叶片远轴化[27]。在叶片发育过程中,YABBY(YAB)是KAN的下游基因,其功能的发挥相对较迟[28]。拟南芥kan1、kan2的单突变体植株没有明显的表型变化[27],但kan1、2双突变体和kanl、2、3三突变体大多数侧生器官的腹面结构被背面结构所取代,叶片的远轴面长了一些类似叶片的器官、远轴面出现大量的异位突起,这些表型都是近轴面化的表现[29]。这些研究表明kan1、2、3维持了叶片的远轴面特性,且彼此之间存在功能冗余。YAB家族是一个植物特异的基因家族,在叶和花中的表达都具有明显的极性。fil[30]和yab3[31]的单突变体没有明显可见的表型缺陷。然而fil和yab3的双突变体叶及叶脉形态发生了明显改变,产生了狭长的叶片,其远轴表皮既有近轴特点又有远轴特点。这说明fil和yab3参与了远轴面极性特征建立的过程,二者之间存在一定的功能冗余,而其功能的缺失会在远轴位点引发形成异位的近轴细胞。值得注意的是在水稻中Roc5基因编码一个HDZIP/Ⅳ转录因子,调控了类表皮生长因子(PFL , Protodermal FactorLike)基因的表达,Roc5突变体中泡状细胞异常膨大导致叶片向远轴面卷曲[32]。

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