水稻是世界上重要的粮食作物，由稻瘟病菌引起的稻瘟病能对水稻造成毁灭性灾害，目前抗病育种是控制稻瘟病最有的效方法之一。前期研究已从地方抗病品种黑壳子粳中鉴定出了一个具有小种专化性的抗病基因Pi-hk2，并将其定位在标记ILP9和RM24028之间262kb区域内。本研究利用精细定位的方法，在该区域开发新的分子标记，结合表型分析将Pi-hk2定位于标记ID-M44和ID-M23之间共63Kb的区域。基因预测表明，该区域包含9个候选基因，其中5个编码功能蛋白，4个编码与反转座子有关的蛋白。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
材料与方法2
1.1植物材料与群体构建 2
1.2基因组DNA的提取（TPS法）2
1.3 InDel分子标记的开发2
1.3.1分子标记的设计2
1.3.2多态性检测和退火温度的确定3
1.4 PCR 扩增及其产物的电泳检测3
1.4.1分子标记的 PCR 扩增3
1.4.2 分子标记的电泳及检测3
1.5 幼苗培养4
1.6供试菌系与产孢培养4
1.7 接种4
1.8 病情调查4
1.9 候选基因的测序与预测5
2 结果与分析5
2.1交换单株筛选5
2.2分子标记多态性5
2.3 Pihk2的精细定位5
2.4候选基因预测6
2.5候选基因测序比对结果与分析7
3 讨论 7
致谢8
参考文献9
附录11
水稻地方品种黑壳子粳稻瘟病抗性基因Pihk2的精细定位与克隆
引言
水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物，世界上一半的人口以水稻为主食，其产量和质量对解决粮食问题、维持经济状况十分重要[1]。稻瘟病由稻瘟菌（Magnaporthe grisea）引起，是世界范围内破坏性极强的水稻病害[2]，广泛发生于不同地区，且在水稻生长各阶段各部位均易发病。每年全球水稻 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
总产量因稻瘟病损失11%30%，损失量足以养活大约6000万人口[3]。目前，发掘新的抗稻瘟病基因，培育和种植抗病品种是稻瘟病防治最有效而环保的方法。
随着遗传分析方法的和分子标记等技术的进步，已有至少69个抗稻瘟病位点共84个主效基因被报道。除水稻3号染色体之外，其余染色体上均有抗病基因的分布，多为成簇分布。其中存在 3 个较大的基因簇，分别位于水稻的第6号、11号和12号染色体上[4]。目前，已获得至少28个稻瘟病抗性基因的克隆[5]，除了Pid2基因编码β凝集素受体蛋白激酶[6]、pi21基因编码富含脯氨酸的蛋白[7]以及bsrk1基因编码TPR结构域[8] 之外，其余25个基因的表达产物均含有核苷酸结合位点以及富亮氨酸重复序列（Nucleotidebinding site and leucinrich repeat，NBSLRR）结构域。此外，有研究发现编码C2H2型转录因子的基因Bsrd1启动子发生单核苷酸突变，突变后的水稻表现出广谱持久的抗病性[9]。抗病基因的定位与克隆是研究水稻抗稻瘟病的机制、培育具有广谱性、持久抗性的水稻品种的基础。
黑壳子粳是太湖流域粳稻地方品种，表现出广谱和高抗的特点，研究表明其对300多个稻瘟病小种都具有抗性[10]。前期研究中，利用太湖地区稻瘟病优势小种20109（G1）对黑壳子粳、苏御糯以及它们构建的重组自交系（Recombinant Inbred Lines，RIL）群体进行接种鉴定，发现9号染色体上存在一个对20109（G1）具有小种专化抗性的主效QTL，将其命名为Pihk2[11]。Pihk2基因属于小种专化抗性基因，严格遵守Flor的“基因对基因假说”[12]。迄今为止，在已深入研究的5对稻瘟病抗病基因（R基因）和病原物无毒基因（Avr基因）的互作中，仅Pita被报道为小种专化抗性基[13]。因此，Pihk2基因的定位与克隆将有助于发掘水稻抗稻瘟病机理，揭示宿主和病原体之间相互作用的分子机制，为水稻抗稻瘟病育种提供新的资源。本研究拟在先前的定位基础上进一步对Pihk2基因进行精细定位，缩小定位区间并进行候选基因的预测，对具有持久抗瘟水稻品种的培育至关重要。
1 材料与方法
1.1 植物材料和群体构建
在前期研究中，以太湖流域具有稻瘟病广谱抗性的地方品种黑壳子粳和感病品种苏御糯为亲本构建了162个重组自交系群体RILs（Recombinant Inbred Lines）（F2:9），从中挑选出了一个携带目的基因的抗病家系RIL84，将该家系与感病亲本苏御糯回交后连续自交。目前，利用BC1F4和BC1F5群体已将Pihk2定位到分子标记ILP9和RM24048之间262 Kb的区域内。本研究则利用BC1F4和BC1F5的自交后代BC1F5（863株）和BC1F6（3337株）群体用于Pihk2的精细定位。
1.2基因组DNA的提取（TPS法）
（1）水稻上取下的叶片放置于4℃保存，取约0.2 g水稻叶片剪成5mm的小段放到2.0 ml Eppendrof管中。在每管中放一粒玻璃珠，液氮中冷冻1 min，用磨样机磨碎。
（2）每管加入500600ml TPS溶液，颠倒混匀后65 ℃静置2h。
（3）取出样品，20000rpm离心10min。
（4）取96孔板中，每孔加130ml异丙醇，按体积1:1加入离心后的上清液。20℃放置12h。
（4）3000rpm离心2min。

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