4个灰飞虱p450基因的体外表达及酶活测定【字数：4046】
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 2
1．1 主要试剂及仪器 2
1.1.1供试昆虫细胞 2
1.1.2 主要试剂 3
1.1.3 实验仪器 3
1．2 昆虫细胞SF9的贴壁培养 3
1．3 重组杆状病毒质粒的构建 3
1.3.1 转染SF9细胞得到P1代病毒 3
1.3.2 扩增P1代得到P2代病毒 4
1.3.3 扩增P2代病毒得到较高病毒滴度的P3代病毒 4
1.4 利用P3代病毒表达解毒酶蛋白 4
1.5 酶液蛋白含量的测定 4
1.6 以对硝基苯甲醚（PNOD）为底物的酶活力测定 4
2 结果与分析 4
2．1 重组表达和P450酶活测定 4
2.1.1 CYP66410酶活性的测定结果 4
2.1.2 CYP90969酶活性的测定结果 5
2.1.3 CYP9276酶活性的测试结果 5
2.1.4 CYP78164酶活性的测定结果 5
3 讨论 6
致谢 6
参考文献： 6
4个灰飞虱P450基因的体外表达及酶活测定
引言
昆虫抗药性机理主要包括四种：分别是行为抗性、穿透抗性、代谢抗性和靶标抗性(Denholm等，2002）[1]。代谢抗 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: @351916072@
性是昆虫适应外部条件，应对环境压力所产生的生理生化的转变，是昆虫产生抗性的主要机制。经报道，灰飞虱细胞色素P450多功能氧化酶（Mixed function oxidase，MFO）在灰飞虱的代谢抗药性中起到了重要的作用[2]。
多功能氧化酶系是位于细胞内质网上的多酶复合体，主要由细胞色素P450、细胞色素b5、NADPH细胞色素P450还原酶、NADPH细胞色素b5还原酶和磷脂等构成。其中，细胞色素P450起末端氧化的作用，存在着与膜结合和可溶性两种形式，能够催化各种内源和外源物质的氧化，与昆虫抗药性的产生有着密切的关系[3]。P450基因在昆虫抗药性中的作用机制主要包括P450的基因突变和P450的过量表达[4]。
前期的研究工作发现，灰飞虱的四个P450基因在抗性品系中过量表达，与杀虫剂的代谢抗性可能相关。为了进一步明确这四个灰飞虱细胞色素P450基因的功能，本研究利用昆虫杆状病毒表达系统对四个P450基因进行了体外表达和酶活性的测定，为进一步的功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 主要试剂及仪器
1.1.1供试昆虫细胞
实验室保存的SF9细胞系。
1.1.2 主要试剂
含有10%FBS（胎牛血清）的SF9900ⅢSFM细胞培养基，DNACellfectinⅡ混合液，Cellfectin转染试剂，Grace培养基，PH =7.4的PBS溶液，PH =7.8的PBS溶液等。
1.1.3 实验仪器
主要仪器见下表。
主要仪器表
Main instruments table
仪器设备
生产商
制冰机SIMF124
日本SANYO公司
4℃离心机Micro 21R
美国Thermo公司
荧光体式显微镜SMZ1500
日本NIKON公司
核酸蛋白测定仪
德国Eppendorf公司
多功能酶标仪
美国分子仪器公司
1．2 昆虫细胞SF9的贴壁培养
SF9细胞培养在含有10%FBS（胎牛血清）的SF9900ⅢSFM细胞培养基中，贴壁培养于细胞瓶，27℃恒温生化培养基中避光培养，平均2~3天传代一次。
1．3 重组杆状病毒质粒的构建
1.3.1 转染SF9细胞得到P1代病毒
使用Cellfectin转染试剂，将鉴定成功的目标Bacmid DNA，转染到昆虫细胞SF9中，以产生重组杆状病毒。转染方法如下：
在直径为25mm的6孔细胞培养板中，加入2ml/孔含10%FBS的SF900ⅡSFM培养基，每孔接种8×105个处于对数生长期的SF9细胞，细胞活性大于95%。
27℃生化培养箱避光培养12h；
将原细胞培养基去除，换为无抗生素、无血清的Grace’s Insect Medium，置于27℃生化培养箱避光培养1h。
准备DNACellfectinⅡ混合液；
取1µg重组杆状病毒质粒，加入100µl不含抗生素和血清的Grace’s细胞培养基，充分混匀；
取Cellfectin转染试剂，颠倒混匀后将8µl CellfectinⅡ加入100µl无抗生素、无血清的Grace’s培养基，充分混匀；
原文链接：http://www.jxszl.com/nongxue/zwbh/561539.html
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