梨锈水病是我国梨树上专有的一种细菌性病害，由方中达迪基氏（Dickeya fangzhongdai）引起。该病害是威胁梨树的一种毁灭性病害，发展迅速，危害性大。III 型分泌系统（type III secretion system，T3SS）是革兰氏阴性细菌的一种关键毒力因子，可以参与并调节多种反应，如生理生化反应和细胞的生命活动等。为了明确hrcJ基因在D. fangzhongdai中的致病作用，本论文以梨锈水病菌JS5为材料，采用同源重组的方法构建了hrcJ基因的缺失突变体ΔhrcJ，并对突变体和野生菌株一同进行了致病性及与致病能力相关的一系列表型测定。结果表明，与野生型相比，突变体ΔhrcJ 对梨叶片和梨果的致病力、生物膜的形成能力显著下降，以及hrcJ基因缺失后，突变体丧失了激发烟草过敏反应的能力。此外，hrcJ基因不影响病原菌的生长速度和胞外酶活性。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1．1．1 菌株、质粒和培养条件 2
1．1．2 生化试剂、引物和其他材料 2
1．1．3 常用培养基、溶液和缓冲液 3
1．2 实验方法 4
1．2．1 细菌基因组DNA提取方法 4
1．2．2 质粒的小量提取 4
1．2．3 热激感受态Top10 和S171的制备 5
1．2．4 PCR/酶切产物回收 5
1．2．5 普通PCR反应体系 5
1．2．6 目标基因缺失突变载体的构建 6
1．2．7 突变体菌株表型测定和分析 7
2 结果与分析 8
2．1 自杀性重组载体的构建 8
2．2 突变体的筛选和验证 9
2．3 ΔhrcJ对梨叶片和梨果的致病性下降 10
2．4 ΔhrcJ不能引起烟草过敏性反应 10
2．5 ΔhrcJ生物膜形成能力下降 11
2．6 ΔhrcJ游动性变化不显著 11
2．7 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
ΔhrcJ胞外酶活性变化不显著 11
2．8 ΔhrcJ生长能力未出现明显变化 12
3 讨论 13
致谢 13
参考文献 13
梨锈水病菌hrcJ基因功能研究
引言
引言
梨锈水病是我国梨树上一种毁灭性的细菌性病害，最早在20世纪70年代由殷恭毅和徐雍皋先生在江苏徐淮地区发现[1]，目前在江苏、浙江、山东等省均有关于梨锈水病的报道。据文献记载，此病主要为害梨树的骨干枝，病害发展迅速，危害性大。发病初期树皮外表无明显病斑，从皮孔、叶痕、伤口等处渗出锈色水珠或有锈水突然渗出，用刀削开皮层，才可见皮层呈淡红色并有褐色小斑或血丝状条纹，腐皮松软充水，有酒糟味，内含大量细菌。发病后期从孔口渗出大量液体，颜色由最初的无色，23小时内变为乳白色、红褐色，最后呈铁锈色，具粘性。部分病枝因皮层腐烂树木迅速枯死。锈水不多的轻病枝，枯死慢或不枯死，树叶变红早落，树势大减。基于生物学和分子生物学分析，确定了梨锈水病的病原物为Dickeya fangzhongdai[2]。
革兰氏阴性病原细菌在寄主植物上的致病性( pathogenicity)或寄生性（parasitic）和非寄主植物上的过敏性反应( hypersensitive response)都是由其 hrp 基因簇决定的[3]，hrp基因簇编码的Ⅲ型分泌系统( type Ⅲ secretion system，T3SS)在细菌致病过程起着决定性的作用，其核心功能是将细菌分泌的效应蛋白递送到宿主细胞中，并调节宿主细胞的功能，如果没有T3SS，这些病原细菌就无法击败基础防御，在植物中生长，在寄主中产生病变，或在非寄主中引发HR[4]。在植物病原细菌的T3SS中已鉴定出 9个 hrc基因，组成 Ⅲ 型分泌系统的这 9个基因在动植物病原细菌中是高度保守的，具有将 Avr蛋白转运穿过植物细胞壁和细胞膜的能力[5]。
相关研究结果显示，HrcJ 蛋白是位于丁香假单胞菌（Pseudomonas syringase pv. syringae）内外膜之间的一种脂蛋白[6]。在水稻细菌性条斑细菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola ）中，hrcJ 缺失突变体丧失了致病性和在烟草上的 HR激发能力，说明hrcJ 基因是水稻条斑病菌致病性和非寄主上激发 HR 的关键因子，该基因产物参与了 T3SS 装置的形成[7]。在欧美杨细菌性溃疡病菌（Lonsdalea quercina subsp. populi ）中，hrcJ 缺失突变体致病性显著下降，基本丧失了在烟草上的 HR激发能力[8]。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 菌株、质粒和培养条件
供试菌株和质粒见表1.1。梨锈水病菌野生菌株JS5为本实验室保存。D. fangzhongdai和大肠杆菌用LB/LA培养。其中D. fangzhongdai在28℃生化培养箱中培养，大肠杆菌在37℃生化培养箱中培养，液体培养时，摇床转速为220 rpm/min。
表1.1 供试的菌株和质粒
Strains and Plasmid
Characteristics
Sources
JS5
D. fangzhongdai Wild type,RifR
This lab
ΔhrcJ
hrcJ knockout mutant of JS5,RifR,KmR
This study
Escherichia coli
Top 10
recA1 creC10 hsdR17 endA1 zbf5
This lab
S171
recA, Λpir pro hsdR
This lab
Plamids
pEX18GM

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