芽孢杆菌（Bacillus spp.）是最有效的生防细菌之一，有报道表明其所产生的挥发性气体对植物病原菌具有明显的抑制效果。本文采用分隔平板抑菌法研究了分离自马来西亚的50株野生芽孢杆菌菌株产生的挥发性化合物对水稻白叶枯病菌的抑菌效果，结果表明其中8株芽孢杆菌抑菌效果良好，其对水稻白叶枯病菌的菌落面积抑制率均达到了50%以上。进一步研究表明，D13菌株和OKB105菌株产生的挥发性有机化合物能够明显抑制水稻白叶枯病菌的生长，在第6天时D13菌株和OKB105菌株处理的病菌菌体数量分别只有对照的68.6%和79.8%。显微观察发现，D13菌株和OKB105菌株产生的挥发性有机化合物还能破坏病原细菌的菌体结构。通过16s rDNA和gyrB扩增和测序分析，确定芽孢杆菌D13属于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1菌株 2
1.2培养基 2
1.3 试剂与引物合成2
1.4 菌株的分离纯化2
1.5 抑菌体系建立2
1.6抑菌菌株筛选3
1.7芽孢杆菌挥发性化合物对水稻白叶枯菌量的影响3
1.8芽孢杆菌挥发性化合物对水稻白叶枯菌体形态的影响3
1.9芽孢杆菌基因组提取3
1.10 16S rDNA鉴定 3
1.11 gyrB基因鉴定4
2 结果分析5
2.1 抑菌体系的建立5
2.2抑菌菌株筛选6
2.3 芽孢杆菌挥发性化合物对水稻白叶枯菌的影响6
2.4 芽孢杆菌D13菌株鉴定8
3 讨论 9
致谢10
参考文献10
芽孢杆菌产生的挥发性物质抑制植物病原细菌的研究
引言
引言：近年来，植物及微生物等所产生的挥发性气体在一定程度上对抑制病原菌生长、提高植物抗逆反应等方面均有明显效果[12]。而芽孢杆菌作为一类重要的植物根围促生细菌（Plant Growth *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 
Promoting Rhizobacteria, PGPR），可以产生各种抑菌物质和诱导植物产生系统抗病性（Induced Systemic Resistance, ISR）防治植物病害。芽孢杆菌挥发性物质具有低分子量、亲脂性等特点，使其与微生物其他性质的次级代谢产物相比，具有能够长距离传播、低浓度即可被感知等优势[3]，因此，在促进植物生长发育方面具有良好的成效；而其与非挥发性抗菌物质相比，挥发性抗菌物质更易于在土壤或空气中渗透和扩散，能更有效地杀灭病原菌接种体，达到抑菌的作用[4]。此外，芽孢杆菌挥发性物质还能够诱导植物产生ISR（诱导性系统抗性），通过外界环境条件的刺激，增强植物本身对生物侵扰的防御能力。随着科技的更新发展，芽孢杆菌产生的挥发性物质极有可能开辟出一条安全、无毒的防治病虫害的新途径[5]。必将在未来的有害生物综合治理中，起着举足轻重的作用。到目前为止，对微生物挥发性物质的研究主要集中在抑制真菌方面，而本实验将对微生物挥发性物质对植物病原细菌的抑制作用进行研究[6]。
1 材料与方法
1.1 菌株
来自马来西亚地区分离的50个芽孢杆菌菌株。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）OKB105由本实验室保存。
1.2 培养基
芽孢杆菌培养使用LB培养基；水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo） 培养使用NA培养基。
LB培养基配方： Tryptone 10g; NaCl 10g; Yeast extract 5g;
Agar 15~18g
NA培养基配方：polypeptone 5g; sucrose 10g; Yeast extract 1g;
Beef extract 2g; Agar 18g
1.3 试剂和引物合成
PCR扩增反应试剂购自TaKaRa公司。引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。PCR产物小量切胶纯化试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。
1.4 菌株的分离纯化
1.4.1 ：甘油保存菌株
用无菌枪头吸取50µl 60%的甘油和50µl菌株加入离心管中，充分摇匀后，于20℃冰箱中保存。
1.4.2 ：菌株的纯化
（1）平板划线分离：无菌枪头吸取用甘油保存的菌液，在LB培养基上用平板划线分离法进行纯化，放入37℃培养箱培养12h。
（2）接菌：将上述培养基的单菌落用灭过菌的牙签沾取后放入LB液体培养基中，放入37℃摇床，24小时后待用。
1.4.3 所需要准备的材料与试剂：
（1）60%甘油（60ml甘油，加入水定容至100ml，121℃灭菌20min）
（2）50个干燥的50ml三角瓶（121℃灭菌20min）
（3）50个离心管(121℃灭菌20min，烘干)
（4）50个平板（121℃灭菌20min，烘干）
（5）2瓶牙签（121℃灭菌20min，烘干）
（6）5L LB固体培养基（200ml一瓶，使用500ml三角瓶分装，121℃灭菌20min）
（7）1L LB液体培养基（2050ml每瓶，使用50ml三角瓶分装，121℃灭菌20min）
1.5 抑菌体系建立
1.5.1 芽孢杆菌产生的挥发性物质抑菌体系建立
为了得到最佳的抑制植物病原细菌生长的效果，对芽孢杆菌的培养基以及芽孢杆菌的菌量进行筛选，以期能够达到最明显的抑制效果，同时也为之后的芽孢杆菌菌株筛选提供基础和依据。
方法：
在具分隔的培养皿中，一边倒入NA固体培养基，另一边倒入LB固体培养基（两边培养基均不没过横隔）。待培养基冷却凝固后，用灭过菌的枪头在NA培养基上滴加10µl 108cfu/ml Xoo菌液，分别在LB培养基上滴加10 µl、30 µl 108cfu/ml B. subtilis OKB105 菌液，以滴加相应体积的LB液体培养基为空白对照[7]。每个处理做3次平行重复。待菌液吹干后，将培养皿密封后放入28℃的恒温培养箱中培养6d，观察结果。将OKB105菌液在NA培养基上培养，重复上述实验过程，观察结果。

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