生物除草化合物TeA人工模拟合成工艺优化及其生物活性评价[20200614172053]
摘要： 2
摘要：细交链孢菌酮酸（Tenuazonic acid ,TeA）是链格孢菌的代谢产物，具有显著的除草活性，主要抑制光系统II的D1蛋白，引起活性氧爆发，抑制或杀死杂草。人工模拟合成出具有生物源一样的除草活性，是产业化的关键。在不使用苯[1]和甲苯的基础上延长反应时间，亦能够合成出TeA，但是对长达16小时的N-乙酰乙酰基-L-异亮氨酸甲酯的合成反应温度未有明确说明。本文对16小时的N-乙酰乙酰基-L-异亮氨酸甲酯的反应温度进行梯度设置，以L-异亮氨酸为反应起始物，经过3个主要步骤，合成TeA，进行产率的计算和生物活性评价。生物活性评价表明合成产物具有明显的致病活性。
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关键字:杂草；细交链孢菌酮酸（TeA）；化学合成
目录
引言
引言
链格孢菌[Alternaria alternata (Fr. ) Keissler] [2]是紫茎泽兰自然致病真菌之一[3][4]。强胜等[5][6]发现, 从紫茎泽兰自然发生的叶斑病病斑上分离筛选出的链格孢菌[Alternaria alternata (F r. ) Keissler ]能产生致病毒素：细交链孢菌酮酸（TeA）。该物质具有广谱、快速、高效的杀草活性[7]。戴新宾等[8](2004)研究发现该毒素可抑制紫茎泽兰叶片的光合作用，作用位点在类囊体膜上，主要抑制两个光系统的电子传递活性[9]。陈世国等（2007）[10]进一步研究表明TeA主要作用与光合作用光反应的光系统II(PSII)的D1蛋白，从而能够完全抑制PSII电子传递活性[11]，引起活性氧的爆发，导致氧化伤害杂草组织[12]，而最终杀死杂草[13]。
TeA的结构如图1所示
图1 TeA的结构
其具有至少3个同分异构体，人工模拟合成的化合物活性常因此发生异构化，导致活性不稳定。因此，探寻合适的合成路线和工艺，就成为产业化的关键。
TeA的主要合成方法目前主要的是酰氯法和氯化亚砜法。根据Lohrey Lilia[14] 等（2013）所使用的酰氯法，有8种溶剂，反应过程复杂，虽然产率最终有96%，但是其原材料成本远远高于工业生产的承受范围，且耗时长，过程条件控制严格。而根据Asam Stefan[15]等（2011）使用的氯化亚砜法，需要用到甲苯等有剧毒的原材料，不利于工业生产，且材料成本高，产率低。根据Wang XF[1]等（2010）使用的氯化亚砜法，产率只有71%，生产原料中应用到苯。 根据杨春龙[16]（2009）使用的合成方法，反应条件需要严格无水，且需要使用无水苯和新 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$ 
制甲醇钠，产率仅为57.8%。
本课题应用化学合成的方法，以L-异亮氨酸为反应起始物，经过三个主要步骤，合成TeA，在反应过程中避免使用无水苯，且通过反应过程条件的摸索，增加终产物的产率，最后通过针刺试验验证合成产物的活性[17]，并对所得数据进行方差分析[18]，探究不同温度合成的TeA对叶效实验中的病斑直径间是否有显著性的影响。本实验所采用的合成方法在提高了反应效率的同时缩短了反应的时间，初步探索出一条高效环保的TeA合成方法。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 供试植物
紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng)为温室培育的实生苗，培养时间为5个月。
1．1．2 试剂
L-异亮氨酸；无水甲醇，石油醚，钠，乙酸乙酯，无水乙醇，氯化亚砜，双乙烯酮，无水硫酸镁，无水乙醚，盐酸。试剂均为为分析纯。
1．1．3 仪器和设备
玻璃仪器：500ml三口瓶、500mL烧杯、玻璃棒、磁子、单口烧瓶、直流冷凝管、恒压漏斗、普通漏斗、500mL抽滤瓶
冷阱: XODC-2006型低温恒温槽，冷却水循环系统：大学20096089，ELELA(CCA-1111)型冷却水循环装置；
蒸馏系统：ELEVA（NVC-2100）型旋转蒸发仪（控制器），ELEVA(SB-2000)型恒温水浴锅，真空控制器（大学20096090），旋转蒸发仪：EYELA(N-1001)；
恒温加热磁力搅拌器；SHB-3A循环水多用真空泵；JJ-1精密增力电动搅拌器；
其它：棉花、滤纸
1．2 方法
本课题应用化学合成的方法，以L-异亮氨酸为反应起始物，经过三个主要步骤，合成TeA，在反应过程中避免使用无水苯，且通过反应过程条件的摸索，增加终产物的产率，最后通过针刺试验验证合成产物的活性[17]，并对所得数据进行方差分析[18]，探究不同温度合成的TeA对叶效实验中的病斑直径间是否有显著性的影响。
TeA总的实验反应如图2所示：
图2 TeA合成反应路线示意图
1．2．1 L-异亮氨酸甲酯盐酸盐的合成
在装有温度计、电动搅拌（密封）、恒压滴漏斗的500mL四口瓶中加入125mL无水甲醇，于冰盐裕中冷至-8℃，搅拌下缓慢滴加1.2mol氯化亚砜（滴加时温度至少保持在-5℃以下），甲醇与氯化亚砜的反应比为1:1.2。滴完后在-11℃以下搅拌反应1h，加1mol L-异亮氨酸，升温至室温（内温25℃）搅拌反应3h，加热回流（内温65℃）反应4h。
反应处理：旋转浓缩所得物，直到无氯化亚砜和HCl为止。用乙酸乙酯和石油醚重结晶剩余物，加入氨基酸甲酯盐酸盐重结晶作为晶核。抽滤，干燥，得L-异亮氨酸甲酯盐酸盐结晶。保留母液，再次析晶，最后合并产品，计算收率。
1．2．2 N-乙酰基-L-异亮氨酸甲酯的合成
在装有温度计、电动搅拌（密封）、恒压滴漏斗的500mL四口瓶中加入181.7g L-异亮氨酸甲酯盐酸盐(1mol)和250mL甲醇，滴加54.0g甲醇钠(1mol),过滤，根据所得的NaCl的量计算收 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$ 
益，并确定滴加的双乙烯酮的量，其与产物的摩尔比分别1:1.05。
冷阱中缓慢滴加双乙烯酮，温度不超过10℃。在温度为15℃、20℃、25℃、30℃四种不同的条件下反应，搅拌时间为16h。旋转浓缩除去甲醇及未反应的双乙烯酮。加入100mL乙酸乙酯，溶解后用1M HCl和0.5M NaHCO3溶液各洗涤2-3次，水洗至中性，MgSO4干燥，抽滤，旋转浓缩除去乙酸乙酯，得黄色油状物。
1．2．3 TeA的合成
在装有温度计、电动搅拌（密封）、恒压滴漏斗的500mL四口瓶中加入45.8g N-乙酰基-L-异亮氨酸甲酯（0.2mol），60mL甲醇、甲醇钠溶液（0.19mol，4.4g Na+60mL甲醇）在冷阱中加入到反应溶液中，回流3h，减压脱溶，加水100mL，用乙酸乙酯反复萃取去杂，直到萃取液基本无色。用3mol/L HCl酸化至pH2，溶液静置24h，用无水乙醚萃取，萃取液放置24h，Mg2SO4干燥，旋转蒸发，得深红色产物，测活性。
1．2．4 用合成产物对紫金泽兰进行针刺试验及其方差分析
取紫茎泽兰植株上部位的叶片，先用自来水冲洗0.5h，再用无菌水清洗4次，用灭菌的滤纸吸干叶面水分；在叶背面离叶缘1～2 cm 处针刺造成轻微伤害[19]。
本实验对TeA溶液浓度设定梯度。
2 结果与分析
2．1 L-异亮氨酸甲酯盐酸盐的合成产率原因分析及其改进
图3 L-异亮氨酸甲酯盐酸盐合成反应示意图
此步反应为醇的成酯反应，因是可逆反应，故实际产率与理论产率存在一定差距，若在反应过程中不断去除水（产物之一），提高反应温度，可使平衡右移提高产率。
在反应结束，进行重结晶时，单纯加入乙酸乙酯或者石油醚，产率为60%。在后续进行重复实验时，发现用石油醚和乙酸乙酯进行重结晶，并且加入氨基酸甲酯盐酸盐晶核，不仅能将结晶率提高至80%，还能增加结晶的纯净度。
2．2 N-乙酰乙酰基-L-异亮氨酸甲酯的合成产率原因分析及其改进

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/23961.html