：水分胁迫制约水稻的产量与品质，对水稻生产有重要影响。ABA诱导的抗氧化防护能调节水稻的水分平衡，增强水稻对胁迫的耐性，锌指蛋白ZFP36在其中发挥重要作用。常用的外源强启动子启动基因的过量表达可能会影响到目的蛋白的定位和正常功能，为探究采用CaMV 35S强启动子与ZFP36自身启动子对ZFP36亚细胞定位的异同，克隆ZFP36自身启动子，分别构建含有目的基因的重组原生质体瞬时表达载体35S:ZFP36-YFP和ZFP36: ZFP36-YFP，以PEG融合法转化水稻原生质体，在激光共聚焦显微镜下观察其亚细胞定位。两种融合蛋白均定位在细胞核，CaMV 35S强启动子并不会影响ZFP36蛋白的正常定位，可以在后续实验中继续使用。本篇文章为进一步研究ZFP36如何参与水稻中ABA诱导的抗氧化防护的详细机制及相关机理奠定了基础。
目录
摘要 4
关键词 4
Abstract 4
Key words 4
引言 4
1 材料与方法 5
1.1 实验材料 5
1.1.1 植物材料培养与处理 5
1.1.2 菌株和质粒载体 5
1.1.3 酶及主要分子生物学和生物化学试剂 5
1.2 ZFP36基因的克隆及其重组原生质体瞬时表达载体35S:ZFP36YFP的构建 5
1.2.1 ZFP36基因的引物设计 5
1.2.2 水稻总RNA提取 6
1.2.3 RNA纯度检测 6
1.2.4 水稻cDNA第一链的合成 6
1.2.5 PCR扩增目的基因ZFP36 6
1.2.6 PCR产物的纯化与回收 7
1.2.7 检测胶回收情况 7
1.2.8 目的片段连接T载体 7
1.2.9 重组质粒的转化 7
1.2.10 菌落PCR鉴定 7
1.2.11 碱裂解法提取质粒 8
1.2.12 酶切鉴定 8
1.2.13 DNA序列的测定 8
1.2.14 质粒双酶切 8
1.2.15
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目的基因连接原生质体瞬时表达载体 8
1.2.16 连接产物的转化及转化克隆的筛选及鉴定 9
1.2.17 重组原生质体瞬时表达载体序列测定和分析 9
1.3 ZFP36基因自身启动子的克隆及重组表达载体ZFP36: ZFP36YFP的构建 9
1.3.1 水稻基因组DNA的提取 9
1.3.2 ZFP36启动子预测分析 9
1.3.3 ZFP36启动子的克隆及重组质粒的鉴定测序 9
1.3.4 重组原生质体瞬时表达载体ZFP36: ZFP36YFP的构建 9
1.4 水稻原生质体分离、转化及处理以及观察亚细胞定位 10
1.4.1 水稻原生质体的分离 10
1.4.2 质粒提取 10
1.4.3 PEG融合法转化水稻原生质体 10
1.4.4 激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位结果 10
2 结果与分析 10
2.1 RNA纯度检测 10
2.2 目的基因全长的克隆 11
2.3 ZFP36自身启动子的预测、克隆及序列分析 11
2.4 重组原生质体瞬时表达载体的构建及鉴定 12
2.4.1 重组原生质体瞬时表达载体35S:ZFP36YFP的构建及鉴定 12
2.4.2 重组原生质体瞬时表达载体ZFP36: ZFP36YFP的构建及鉴定 12
2.5 水稻原生质体的分离 13
2.6 35S:ZFP36YFP和ZFP36: ZFP36YFP融合蛋白在水稻原生质体中的亚细胞定位 13
3 讨论 14
致谢 16
参考文献 17
附录 18
水稻锌指蛋白ZFP36的亚细胞定位研究

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