：镉是一种重金属元素，过量的镉对植物的生长发育有毒害作用。玉米是我国一种重要的粮食作物，但是目前日益严重的镉污染正威胁着玉米的生长，因此对玉米耐镉性的研究成为了一个重要的课题。本课题将研究玉米耐镉基因的筛选，运用基因工程技术将玉米文库质粒转化到Δycf酵母菌株中，确定pDEST22空载的耐镉限度及具有耐镉基因的单菌落，进行菌落PCR扩增检测并送去测序，将结果进行基因Blast比对，得到具有耐镉性的基因。通过实验确定了空载耐镉浓度为50µM。通过菌落PCR跑胶检测和测序发现，得到8种可能具有耐镉性的基因，如H3组蛋白基因、ABA胁迫水果成熟诱导蛋白基因等。耐镉基因的成功筛选为植物耐镉性的研究提供了很好的研究材料和思路。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料及试剂2
1.1.1 材料2
1.1.2 试剂2
1.2 方法 3
1.2.1 设计引物3
1.2.2 酵母感受态的合成及转化3
1.2.3确定耐镉限度3
1.2.4菌落PCR及电泳3
1.2.5 基因比对4
2 结果与分析4
2.1 文库质粒生长情况4
2.2 菌落PCR跑胶检测4
2.3 基因比对结果5
3 讨论5
3.1 实验过程及结果分析 5
3.2 结果展望 6
致谢6
参考文献6
附录8
玉米耐镉基因的筛选
引言
引言 重金属指比重大于4或5的金属，如镉、铜、铅、铁、镁、锰等。化学、生物途径基本不能降解重金属污染物，其在植物，动物和人体内积累的主要途径为食物链，具有很大的毒性，严重威胁生态环境、食品安全和人体健康[13] 。土壤重金属污染的成因有人为和自然两种，其中人类的各种不环保行为构成了土壤重金属污染的主要成因。 土壤重金属污染的自然来源主要是岩石风化和火山喷发等自然地质活动，人为来源主要有 金属冶炼、化工及煤燃烧、矿产开采、
 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
汽车尾气及生活废水的排放、擅自使用污泥、污水灌溉、农药和化肥的施用紊乱等[4]。重金属污染对人体健康的危害主要是“三致”即致癌、致疾、致突变。以重金属镉为例，如果长期接触一定剂量的镉，会对肾脏功能造成一定程度的损害，进而导致常见的骨质疏松和软化[5]。
镉（Cd）元素不但不是生物生长发育的必需元素，且具有很强的生物毒性，对农田的安全生产危害极大，是危害严重的农田污染源的其中一类。随着现代农业的不断快速发展，农药和化肥的用量、工业“三废”以及固体废弃物的数量也相应快速增加，结果导致农田土壤中镉的浓度迅速提高，镉污染问题日益严峻[6]。镉元素对植物的生长发育有显著影响。前人研究发现，镉对植物的影响包括其可以使植物叶片失绿、损害光合系统等， 此外一些和代谢相关的酶的活性也与镉胁迫有关，受其影响[7]。
玉米是中国重要粮食作物，镉胁迫能够显著抑制玉米生长进而降低玉米产量，而随着工业化进程，目前中国玉米生产日益受到镉胁迫的严重影响，分析玉米对镉胁迫的响应机制，研究并筛选玉米中的耐镉基因，对于中国玉米安全生产具有重要意义[810]。目前，随着分子生物学和基因工程技术的发展，利用各种基因手段及分子生物学技术研究玉米的耐镉基因并提取，分析其具体耐镉机制，为以后进一步利用基因工程等手段研究新的抗逆玉米品种打下坚实的基础[1112]。
目前，分离植物耐重金属基因一般使用以下两种方法: ①筛选重金属敏感突变体后分离其耐重金属的基因；②利用mRNA 差异显示技术分离其耐重金属基因。但是这两种方法都存在其局限性。第一种方法要求研究的植物的突变体比较容易筛选出来；第二种方法的具有较高的假阳性，特别是很难检测出低丰度的mRNA [1316]。近几年来，有研究者提出功能筛选方法，即因为酵母与高等植物在一些耐重金属胁迫应答反应上相似性较高，而且两者的一些耐重金属基因的功能均具有保守性和互补性，所以可利用生物技术手段使高等植物的基因在酵母异源体系中表达，同时与高重金属筛选法相结合，从而获得植物耐重金属相关基因[1719]。目前通过功能筛选方法，已经克隆鉴定了一些耐重金属相关基因。已经有一些关于从水稻、大麦、小麦等作物中筛选出耐镉基因的研究，但是目前尚没有研究利用酵母的特性，从玉米中筛选出耐镉基因。
基因克隆的重要方法之一就是cDNA 文库的构建和筛选，可利用它来发现新基因和研究基因的功能[20]。从cDNA 文库中可以筛选到目的基因，并直接用于该基因的表达。
1 材料与方法
1．1 材料及试剂
1．1．1 材料
Δycf酵母菌株、玉米文库质粒、鲑鱼精DNA。
1．1．2 试剂
酵母单缺Trp配方：20g/L葡萄糖（Glucose）、6.7g/LYNB(Yeast Nitrogen Base W/O Amino acids，购于Solarbio公司)、0.74g/L单缺（缺色氨酸Trp，购于TaKaRa公司），调节pH至6.0，固体培养基每100mL加2g琼脂糖，使用前高压蒸汽灭菌，121℃,15分钟。
YPDA（酵母完全培养基）配方：20g/L葡萄糖（Glucose）、20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、0.2% Ade母液（每升YPDA加15mL0.2% Ade母液），调节pH至6.5，固体培养基每100mL加2g琼脂糖，使用前高压蒸汽灭菌，121℃,15分钟。
CdCl2溶液：称取一定量的CdCl2固体，按比例加入去离子水，配成0.1mol/L的CdCl2母液，使用前过滤灭菌。
EDTA母液（372g/mol、pH=8.0）：18.612g的0.5mol/L EDTA溶液、100mL去离子水，NaOH溶液调节pH至8.0，使用前过滤灭菌。
TrisHCl溶液（1mol/L、pH=8.0）：Tris碱12.11g、浓HCl 4.2mL，用去离子水定容至100mL，使用前过滤灭菌。
TE溶液：1mol/L TrisHCl溶液10mL、500mM的EDTA溶液2mL，用去离子水定容至100mL，使用前过滤灭菌。
LiAc溶液：称取一定量的CdCl2固体，按比例加入去离子水，配成1mol/L的LiAc母液，使用前过滤灭菌。
1.1xTE/LiAc：1.1mL10x的TE溶液、1.1mL10x的1mol/L的LiAc溶液，用去离子水定容至10mL。
PEG/LiAc溶液：8mL50%的3350 PEG溶液、1mL10x的1mol/L的LiAc溶液、1mL10x的TE溶液，加热溶解后过滤灭菌。

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/50898.html