短短芽孢杆菌的分离鉴定和转化
*51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: &351916072&
ositive significance to promote Brevibacillus brevis’s application .1 引言现今生产重组蛋白多使用E. Coli由于E. Coli的自身特点，生产过程存在一些不足[1]。Brevibacillus brevis有一些优点，能够有效而简便的生产重组蛋白[2]。Brevibacillus brevis的研究尚在起步阶段。本研究旨在分离筛选鉴定出多株短短芽孢杆菌，然后摸索在不同条件进行转化。主要难点在转化短短芽孢杆菌方法的摸索。该系统可以高效简便的生产重组蛋白质，对农业方面减少生产成本提高生产效率具有重要作用[3]。在工农业系统会有广泛的应用。1.1 重组蛋白的生产 重组蛋白是应用了重组DNA或重组RNA的技术从而获得的蛋白质[4]。是应用基因重组技术，获得连接有可以翻译成目的蛋白的基因片段的重组载体，之后将其转入可以表达目的蛋白的宿主细胞从而表达特定的重组蛋白分子[5]。当前主要应用的重组蛋白的表达载体包括原核细胞如大肠杆菌、真核细胞如酵母、昆虫细胞以及CHO细胞等[6]。产生的重组蛋白作为生物制药的产物，在医学中作用显著[]。目前最常用的表达载体为E. Coli[7]，但该系统存在以下不足之处：E.coli属革兰氏阴性肠道杆菌，是一种潜在的病原菌[8]；生长过程中不断释放脂多糖性质的热原物质,给产物的分离和纯化带来很大困难；由于其细胞包被的复杂结构，因此无分泌胞外蛋白的能力。1.2 短短芽孢杆菌的优点 它具有以下几个优点：Brevibacillus brevis无毒性，所以宿主安全[9]；具有分泌能力，可以分泌各种具有正确折叠结构的蛋白质；因为系统自身存在很少蛋白酶，所以生产的重组蛋白不会被分解，可以完美产出[10]；生产过程简便，只需要发酵；各种培养基的存在，消除了细胞分裂和蛋白质重折叠，使我们得到高效的纯化产品[11]。Brevibacillus brevis有着E. Coli不具有的优点，在生产重组蛋白上有很大优势，该系统的成功构建有很大应用前景[12]。1.3 现阶段的研究状况与难点 Brevibacillus brevis的研究尚在起步阶段[13]。短短芽孢杆菌物种丰富，已有文献报道筛出的各种芽孢杆菌，Takara公司也已经开发出商品化的可用于转化的短短芽孢杆菌[14]。短短芽孢杆菌虽然作为表达宿主具有各种优点，但是其转化困难一直牵制着它的应用，虽然Takara公司已经开发出商品化的可用于转化的短短芽胞杆菌，但其成本较高[15]。1.4 本实验的目标与前景 本实验拟在不同生境筛选出各种短短芽孢杆菌，通过摸索其转化方法，筛选出更适合转化的短短芽孢杆菌和一套优化了的转化方案，进而降低成本，扩大短短芽胞杆菌在工业、农业中的应用[16]。将从不同生境采集土样，热处理获得芽孢杆菌，稀释涂布，菌落PCR扩增短短芽胞杆菌特异性的CWP基因，测序验证所扩基因的正确性，进一步通过16S rRNA基因序列鉴定为短短芽孢杆菌属，拟筛选获得多株短短芽孢杆菌[17]。并摸索出化学转化和电极转化的套路来进行转化。若使用目标达到预期效果，将提供一种更加有效而简便的生产重组蛋白的方式，在工农业方面有很好的前景。2 材料与方法2.1 材料供试土壤：某农田菜园土壤实验试剂： （1）破壁处理液：溶液I（10×TE，pH=7.6），溶液II（KOH-EDTA)，溶液Ⅲ(Tris-HCl，PH=4) （2）转化用的试剂：50mM Tris-HCl（pH=7.5和pH=8.5两种），phosphate buffer，PEG solution，TP medium，MT medium培养基：无机盐培养基；T2培养基；基本培养基。2.2 方法2.2.1 土样的采集 新鲜土壤，从农田菜园植物根部的肥土。2.2.2 土壤菌悬液的制备取5个土样分别加入无机盐培养基中（加0.5%酵母粉），放入30℃摇床过夜培养。然后分别取样5 mL加入7 mL离心管，100℃沸水浴10 min。吸取0.1 mL土壤悬液加入到盛有0.9 mL的1.5 mL离心管中充分均匀，一次类推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，不同稀释度的土壤溶液[18]。2.2.3 平板涂布 将稀释度为10-3-10-5的各稀释液200 mL分别涂布于T2培养基中，并确保涂布均匀。2.2.4 培养 倒置于30℃培养箱过夜培养。2.2.5 芽孢杆菌的分离 淡黄色透明菌落即为疑似芽孢杆菌，将疑似单菌落进行编号。2.2.6 菌体总DNA的提取（1）破壁处理 分别加入2.7 mL溶液I，3mL溶液II，24.3 mL dd H2O于PCR管中，用白枪头挑疑似单菌落于上述PCR管中吸打。于70℃下水浴20 min，然后加入3 mL溶液Ⅲ并吸打，放置10 min。（2）上述所得即为DNA模板 2.2.7 PCR扩增PCR反应体系如下：dNTP mixer(2.5 mM)12.5 mL引物1(25 mM) 0.5 mL引物2(25 mM) 0.5 mL模板DNA(10ng/ mL) 3 mLdd H2O8.5 mL反应条件如下： 95℃ 5 min94℃ 30 s56℃ 30 s72℃ 40 s72℃ 5 min10℃ 5 min2.2.8 PCR扩增产物进行0.75%的琼脂糖凝胶电泳检测验证 PCR产物吸取5mL进行电泳。如果在270 bp左右扩出明显条带将这个菌进行16S rRNA基因测序分析。2.2.9 16S rRNA基因测序 经质粒提取及质粒酶切分析，挑选具有插入片段大小正确的转化子或质粒进行测序。测序由南京金斯瑞生物技术有限公司完成。将我们得到的菌株的16S rRNA基因测序结果在NCBI和RDP数据库中分析，与其中的16S rRNA基因序列进行同源性比对并下载同源性高的序列。来确定是否是短短芽孢杆菌。2.2.10 质粒pUB110的提取（1）取含pUB110的枯草芽孢杆菌，接种于50 ml LB(zeo20)培养基中，放于37℃摇床过夜培养；（2）DNA吸附柱平衡处理：向吸附柱中加入200 mL buffer CBS，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回到收集管中备用。（3）根据菌液生产情况，取4 mL LB培养基过夜培养的菌液，8000 rpm离心1 min，弃尽上清，加30 mL 50 mg/mL的溶菌酶，37℃水浴锅30 min；（4）加入250 mL Solution Ⅰ，用枪头充分悬浮细菌。（5）加入250 mL Solution Ⅱ，立即温和并充分地上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，直至形成透明的蛋清状溶液，此步骤不易超过5 min。如果未能变得清亮，可能菌体过多，裂解不彻底，应减少菌液量。（6）加入350 mL Solution Ⅲ，温和并充分地上下翻转混合8-10次，室温放置2-5 min。然后12000 rpm，离心5-10 min。（7）将步骤6的上清液转移到套放于2mL收集管内的DNA吸附柱中，室温6000 rpm离心1 min，取出DNA吸附柱，倒掉收集管中废液。（8）将DNA吸附柱重新放回收集管中，加入500 mL WⅠ Solution，12000 rpm，室温离心1 min，倒掉收集管中废液。 （9）将DNA吸附柱重新放回收集管中，加入500 mL Wash Solution，12000 rpm，室温离心1 min，倒掉收集管中废液。（10）重复步骤9的操作一次。（11）倒掉收集管中废液，12000 rpm，室温离心1 min，彻底去除Wash Solution（此步骤不可省略）然后开盖室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中残留的漂洗液。（12）将DNA吸附柱放入一个干净的1.5 mL离心管中，在DNA吸附柱中央加入70 mL dd H2O，37℃放置2 min。12000 rpm，室温离心1 min，离心管中的液体即为包含质粒的溶液；（13）取1-3 mL（适质粒浓度定）进行琼脂糖凝胶电泳检测，纯化好的DNA即可用于后续实验或-20℃冻存。2.2.11 短短芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化（1）细菌过夜培养，稀释一百倍于5 mL同样的T2，37℃培养至OD660nm=1.9，此次实验增加对照组，一个离心管是实验组，一个离心管是对照组，唯一的区别在于实验组加的质粒是pUB110，对照组加的是无菌水。（2）在室温下于40 mL离心管中3000 g，5 min收集细胞。（3）在室温下，用pH=7.5的5 mL的50 mM的Tris-HCl中清洗，离心。（4）重悬于5 mL的50 mM的Tris-HCl pH=8.5中，培养60 min摇床，100 rpm。（5）收集细胞，3000 g，5 min，室温。重悬于500 mL TP。（6）将质粒pUB110，100 mL加入实验组的离心管，而对照组加入100 mL的无菌水。（7）快速加入混合1.5 mL PEG。（8）37℃于摇床中培养转速100 rpm A组15 min，B组30 min，收集细胞，3000g，5 min，室温。（9）重悬于1 ml MT中，37℃培养30 min，转速100 rpm，加0.1 mg/mL的卡纳。（10）继续培养37℃，2 h，转速170 rpm。（11）0.15 mL涂布，对照组倒一个平板，实验组倒3个平板，37℃培养。2.2.12 转化验证 取过夜培养的平板，选取单菌落进行编号。挑取编号的单菌落接种于T2试管(zeo20)中，37℃摇床过夜。第二天将浑浊的试管中的培养基进行提质粒验证。3 结果与分析3.1 短短芽孢杆菌的分离和鉴定 3.1.1 观察平板 平板过夜培养后，观察平板。其中一块有疑似菌落的平板如图1-1。图1-1 疑似菌落平板 图中圈点部分的即为疑似菌落。表现为半透明的淡黄色菌落。3.1.2 凝胶电泳 选取疑似菌落进行破壁处理，获得DNA模板，然后进行PCR扩增。对所得产物进行0.75%的琼脂糖凝胶电泳，所得条带如图1-2。 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 疑似菌落 B47图1-2疑似菌落DNA PCR扩增电泳图 从图可知，8号菌在270 bp左右扩出明显条带，且和对照菌种(B47)在条带上相近，所以这个菌是短短芽孢杆菌的可能性最大。所以，对这个菌进行16S rRNA 基因测序。3.1.3 菌株16S rRNA基因鉴定结果 测得的序列结果见附录。在Eztaxon数据库（http://www.ezbiocloud.net/）中进行BLAST。并构建系统发育树，以确定其分类。通过16S rRNA基因比对（见图1-3），及其系统发育树（见图1-4），我们初步确定该菌种为短短芽孢杆菌，暂命名为S1。图1-3 16S rRNA基因比对图1-4 S1系统发育树3.1.4 短短芽孢杆菌的检测（1）芽孢杆菌的单菌落。见图 1-5。图 1-5 短短芽孢杆菌单菌落（2）蛋白酶检测。对对S1，S2，买的短短，B47，M22，M48进行蛋白酶活性检测。可以明显看到S2水解圈比较大，M22，M48，B47稍微有一点。而买的短短，S1没有水解圈。见图1-6。图1-6 蛋白酶水解检测（3）胞外蛋白电泳。对S1，S2，买的短短，B47的胞外蛋白进行跑蛋白胶。第一块胶顺序是Marker，S1（12,24,48小时），S2(12,24，48小时)，B47(12,24,48小时）。可以明显看出S1的条带少，即胞外蛋白种类少。见图1-7。 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9图1-7 胞外蛋白电泳3.2 质粒的提取和转化3.2.1 质粒的提取 这次提取了pUB110的质粒[19]。对所提取的质粒进行了凝胶电泳，扩出的条带如图2-1。 M 1 pUB110图2-1 pUB110质粒电泳图3.2.2 转化后的处理（1）转化之后取0.15mL涂布，实验组倒3个平板，对照组倒一个平板，37℃培养。各平板菌落情况如表2-2。表2-2 转化后涂布平板上的菌落类别单菌落数挑取单菌落pUB110平板621-3pUB110平板1404-5pUB110平板866-10对照组（加水）00（2）转化之后平板生长情况如图2-3.图2-3 转化后的平板（3）转化之后提取质粒的验证取1-10号转化后的单菌落接种于T2试管（zeo20）中，37℃摇床过夜。第二天将浑浊的试管中的培养基1-10号进行提质粒验证。所得质粒进行凝胶电泳，扩出的条带如图2-4。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M图2-4 转化后的质粒电泳图 如图，可以得知单菌落1号，7号没有转化成功，其他8个转化成功。4 讨论4.1 短短芽孢杆菌转化方法的摸索 根据转化结果，选取的10个单菌落有8个转化成功，可知该转化方法成功率比较高，方法比较成熟。Tris-PEG方法是一种新的转化短短芽孢杆菌的方法.原理是利用碱性的Tris-HCl缓冲液(pH值7.5-8.5)移去短芽孢杆菌的细胞壁蛋白层,留下肽聚糖层和细胞膜包裹细胞,由于肽聚糖层非常薄,在聚乙二醇的介导下DNA能被摄入细胞[20]。这种方法成功率高，是一种优秀的短短芽孢杆菌转化方法。此外，电击转化法也是一种可行的方法。由于本实验时间有限等原因，并没有接触到电转化法。查资料知道电击转化对条件要求比较苛刻，甚至需要对每一菌株进行条件微调，才能取得较好的转化效果[21]。总之，Tris-PEG法是一种比较简单有效的转化方法。4.2 短短芽孢杆菌的应用前景 这里主要说短短芽孢杆菌作为表达载体方面的作用。现今生产重组蛋白总要是利用E.Coil，但是蛋白产物存在各种问题，如不够纯净，折叠不好，糖基化修饰不好等。而且E.Coil自身有潜在致病性，这些问题一定程度上限制了重组蛋白的发展。而短短芽孢杆菌一系列优秀的特点使它有希望替代E.Coil。E.Coil有的缺点它都没有，完全能够高效的生产纯净的重组蛋白。Brevibacillus brevis作为表达载体的主要问题是转化成功率较低，易丢失，表达不稳定。所以，摸索它的转化方法尤为重要。一种优秀的转化方法的发现可以加速它的应用，甚至带来重组蛋白生产工业的大革新。致谢 感谢实验室的陈雪婷师姐，叶斌师兄以及我的舍友张志明，周飞飞和王硕。没有他们无私的帮助，我是无法完成论文工作的。在此表示深深的谢意。参考文献[1] 唐以杰, 陈清池. 利用大肠杆菌获取重组蛋白的研究进展[J]. 广东教育学院学报, 2001, 21(2): 60-67.[2] 彭清忠, 彭清静, 张惟材, 等. 短芽孢杆菌的转化方法[J]. 吉首大学学报, 2004, 25(4): 35-38.[3] Joshi B H, Puri R K. 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Agric Biol Chem, 1989, 53: 3099-3100.附录Ⅰ 实验试剂配方1 培养基（1）无机盐培养基：NH4NO3 1 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，NaCl 1 g/L四种试剂先溶，MgSO4·7H2O 0.2 g/L后溶。（2）T2培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖10 g/L。115℃灭菌30 min。2 试剂phosphate buffer：KH2PO4 1.905 g，KH2PO4 0.852 g，定容至100mLPEG solution：40g PEG6000溶于50mL phosphate buffer，定容至100mLTP medium：1:1混合，phosphate buffer 和double strength T2 medium。MT medium：T2中加入20 mM MgCl2附录Ⅱ 菌株S1 16S rRNA基因序列CGTTCGACGATTTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATCTACCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTTGCGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGCAAACTCCCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGATTGGTTTTAAGAGATTGGCGTCCTCTCGCGAGGTAGCATCCCGTTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGTCTTGTCGACGGCAGTCTCTCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAAGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACCGCTGCCCCGAAGGGAAGCTCTGTCTCCAGAGCGATCAGCGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCACTCTTGCGAGCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTATTGCGTTAGCTGCGGCACTGAGGGTATTGAAACCCCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGCATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAAAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATACCGCTTTCCTCTTCTGCACTCAAGCTACACAGTTTCCGATGCGAACCGGGGTTGAGTCCCGGGCTTTAACACCAGACTTACATAGCCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTCGTCAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTATTCGTCCCTAACAACAGAACTTTACAATCCGAAGACCTTCATCGTTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAAATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTAGGCCGTTACCCCACCAACTAGCTAATGCGCCGCAGGCCCATCTCCCAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTCTTTTCGGATCATGCGATCCAAAAACCTATCCGGTATTAGCATAAGTTTCCCTATGTTATCCCAGTCTGAGAGGCAGGTTGCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAGCCTCCGAAGAGACTCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTCTAATCTCTGGAAGATCCGCGCGTACCGAGTTTCTAATTCCAC
目录
摘要 1
关键字 1
Abstract 1
Key words 1
1 引言 1
1.1 重组蛋白的生产 1
1.2 短短芽孢杆菌的优点 2
1.3 现阶段的研究状况与难点 2
1.4 本实验的目标与前景 2
2 材料与方法 2
2.1 材料 2
2.2 方法 2
2.2.1 土样的采集 2
2.2.2 土壤菌悬液的制备 3
2.2.3 平板涂布 3
2.2.4 培养 3
2.2.5 芽孢杆菌的分离 3
2.2.6 菌体总DNA的提取 3
2.2.7 PCR扩增 3
2.2.8 PCR扩增产物进行0.75%的琼脂糖凝胶电泳检测验证 3
2.2.9 16S rRNA基因测序 3
2.2.10 质粒pUB110的提取 3
2.2.11 短短芽孢杆菌感受态细胞的制备和转化 4
2.2.12 转化验证 4
3 结果与分析 5
3.1 短短芽孢杆菌的分离和鉴定 5
3.1.1 观察平板 5
3.1.2 凝胶电泳 5
3.1.3 菌株16S鉴定结果 5
3.1.4 短短芽孢杆菌的检测..............................................................................................6
3.2 质粒的提取和转化 8
3.2.1 质粒的提取 8
3.2.2 转化后的处理 8
4 讨论 9
4.1 短短芽孢杆菌转化方法的摸索 9
4.2 短短芽孢杆菌的应用前景 9
致谢 10
参考文献 10
附录Ⅰ 实验试剂配方 11
附录Ⅱ 菌株S1 16S rRNA基因序列 11
短短芽孢杆菌的分离、鉴定和转化
引言
原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/50906.html
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