环核苷酸门控通道（CNGCs）是非选择性的阳离子通道，属于电压门控离子通道超家族。在植物中，CNGCs具有保守的跨膜结构域（S1-S6），预示C-末端的环状核苷酸结合域（CNB），和钙调素结合结构域（CaMB）。拟南芥基因组编码的20种假定存在的CNGC基因，这些基因能分类成五种亚科并且在具体的组织与器官中产生明确的功能。本研究首先构建了CNGC10的酵母双杂交Bait载体，再通过酵母双杂交技术、β-半乳糖苷酶进行显色反应来检测CNGCs与CDPK是否存在相互作用。结果表明，CNGC10可以与CDPK11、CDPK4、CDPK3EFN及CDPK32发生较强的相互作用，而与CDPK4EFN、CDPK6的相互作用较弱，与Nub、CDPK21EFN无互作。本研究的结果也为CNGC10的通道活性调节机制的研究提供了一定的研究基础和思路。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1实验中所用宿主菌和载体质粒 2
1.1.2各种酶、试剂 2
1.1.3常用培养基的配制 2
1.2实验方法 3
1.2.1 构建CNGC10的酵母双杂交Bait载体3
1.2.1.1目的片段的扩增3
1.2.1.2琼脂糖胶回收DNA片段 3
1.2.1.3 PscⅠ和HindⅡ双酶切4
1.2.1.4 PCR扩增产物与双酶切产物共转化至AP4酵母中4
1.2.1.5 提取酵母质粒 5
1.2.1.6回转大肠杆菌6
1.2.1.7送样测序6
1.2.23AT筛选6
1.2.3酵母双杂交互作检测8
2 结果与分析9
2.1 构建CNGC10的酵母双杂交Bait载体9
2.2 3AT浓度筛选10
2.3 酵母双杂交互作检测12
3 讨论 14
致谢14
参考文献15
拟南芥钙依赖蛋白激酶CDPK与环核苷酸门控通道的相互作 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072$ 
用研究
引言
引言
花粉管生长是研究细胞极性控制的一个典型的系统。花粉在培养中发芽，通过末端的极性生长延长挤压成管，最终形成相同的圆柱形细胞。众所周知，Ca2+在花粉管的极性生长中起着关键的调控作用。在延长的花粉管的末梢人们发现了极度集中的钙离子浓度梯度。末端集中的钙离子梯度的扰乱会导致花粉管末端的生长发生可逆的中断，然而内部的钙离子水平的升高引起茎轴朝着较高的胞质钙浓度区域弯曲生长。此外，过量的钙会促进肌动蛋白拆卸，可能是通过钙离子依赖的肌动蛋白结合蛋白。钙依赖性蛋白激酶（CPKs）家族，作为植物中主要的Ca2+传感器，参与到花粉管生长的调节当中，而其他的钙传感器也同样被证明参与到这个调节当中。早些的实验表明来自于矮牵牛花的两种CPKs能调节花粉管的生长。拟南芥基因组能编码34种CPKs。通过对花粉管中CPKs功能的全基因组调查，我们先前的研究证实CPK32的过表达造成花粉管生长发生剧烈的去极化，导致末端突起的形成。拟南芥中CPK17和CPK34的分裂造成的花粉管生长速率同野生型相比较，前者有明显的降低。大部分花粉管都不能成功的靶定向胚珠并使其受精。通道介导的钙离子内流在很大程度上是负责在花粉管生长过程中的末端集中的钙离子梯度的形成。环核苷酸门控通道（CNGCs）是非选择性的阳离子通道，属于电压门控离子通道超家族。在植物中，CNGCs具有保守的跨膜结构域（S1S6），预示C末端的环状核苷酸结合域（CNB），和钙调素结合结构域（CaMB）。拟南芥基因组编码的20种假定存在的CNGC基因，这些基因能分类成五种亚科并且在具体的组织与器官中产生明确的功能。先前的实验表明CNGCs作为非特定的阳离子通道的功能可以被环核苷酸激活，也可被 Ca2+/钙调蛋白阻断。迄今为止，几种从拟南芥中产生的CNGCs（例如AtCNGC2, AtCNGC4, AtCNGC11和 AtCNGC12）在病原体和非生物胁迫反应中起到功用。特别是关于这个实验，对于AtCNGC18的一种功能丧失突变体表明在花粉管的生长与受精中有缺陷型的表型。AtCNGC16被确认作为一个重要的调节者，在热胁迫和干旱胁迫的条件下调节花粉的繁殖能力。
而本此实验则是通过双酵母杂交系统来探究所选用的七种CDPKs与CNGC10之间是否存在互作。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1.1.1 实验中所用宿主菌和载体质粒
pMetYCgate载体：购自Clonetech公司,将启动子序列克隆入该载体，转化酵母，获得整合启动子序列的酵母Bait菌
大肠杆菌E. Coli感受态细胞
AP4酵母菌：购买自Clonetech公司，用于酵母双杂交筛选
1.1.2各种酶、试剂
限制性内切酶PscⅠ和HindⅢ
试剂盒：胶回收试剂盒、质粒DNA纯化试剂盒
1.1.3 常用培养基的配制
LB培养基
酵母提取物（Yeast extrsact）
5 g/L
蛋白胨（Tryptone）
10 g/L
NaCl
10 g/L
固体培养基：其中再加体积的1.2%琼脂粉，pH通过HCl或者NaOH调至 7.0，120℃高压蒸汽灭菌。
YPDA培养基
胰蛋白胨（Trypton）
20 g/L
葡萄糖
20 g/L
酵母提取物（Yeastextrsact）
5 g/L
固体培养基加1.5%琼脂粉，高压蒸汽灭菌。
1．2 实验方法
1.2.1构建CNGC10的酵母双杂交Bait载体
PCR克隆CNGC10和CDPKs的编码序列，用限制性内切酶处理Bait载体，转入酵母菌株AP4中进行同源重组，然后提取酵母质粒回转大肠杆菌测序鉴定。
1.2.1.1目的片段的扩增
PCR反应：将B1和B2作为扩增过程中所需要的引物，cDNA文库作为所需的模板，扩增CNGC10的ORF序列。
反应体系50uL:
10× buffer
5 µL
dNTP
5 µL
KODPlusNeo
1 µL
MgSO4(25 mM)
3 µL
PrimerF
1.5 µL

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/55550.html