镉（Cd）是对人和动植物毒性最大的重金属元素之一，易在植物体中积累，这不仅会影响作物的质量和产量，还会对人类健康造成巨大的威胁。耐镉基因的克隆为从遗传水平上提高水稻品种耐镉性打下了基础。本课题以日本晴水稻为材料，围绕验证水稻中参与镉诱导的胁迫的基因这一主题，利用酵母异源互补实验，验证已从水稻cDNA文库中筛选出的耐镉基因是否确实具有耐镉性。本实验通过镉敏感酵母突变株∆ycf1对水稻cDNA文库进行耐镉性筛选，得到了一个编码12-氧-植物二烯酸还原酶（Oxo-phytodienoic acid reductase，OPR）基因，有研究表明，OPR基因在减轻逆境下氧化性伤害中起作用。之后通过酵母异源功能互补实验，比较转入耐镉基因的菌株、空载和野生型在含镉培养基上的长势以及生长曲线测定实验成功验证了OPR基因对镉确实具有耐性。验证OPR基因的耐镉性对后期培育水稻耐镉品种及增加水稻产量方面具有指导意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 酵母菌株与载体2
1.1.2 酶及主要试剂2
1.1.3 主要仪器设备3
1.2 受镉胁迫诱导基因的金属耐性分析 3
1.2.1 水稻叶片总RNA的提取3
1.2.2 cDNA第一条链的合成3
1.2.3 PCR扩增目的基因4
1.2.4 目的基因的回收纯化4
1.2.5 目的基因连接T载体5
1.2.6 连接产物转化DH5α感受态5
1.2.7 阳性克隆的筛选和鉴定5
1.2.8 阳性克隆质粒的小量提取5
1.2.9 酵母表达载体的构建6
1.2.10 酵母感受态的制备6
1.2.11 酵母感受态细胞转化6
1.2.12 酵母异源功能互补实验6
2 结果与分析7
2.1 酵母表达载体的构建7
2.2 酵母异源功能互补实验7
2.3 生长曲线测定实验8
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3 讨论9
致谢9
参考文献10
附录Ⅰ pYES2载体质粒图谱和多克隆位点信息11
水稻耐镉基因的验证
引言
镉(Cd)是一类广泛存在于环境中的重金属物质，然而它作为具有高遗传毒性的污染物，其施放量在过去的200 年中急剧上升。全世界范围内Cd、Pb、Zn和Cu 的年施放量依次为2.2×104、79.6×104、137.2×104和 95.4×104吨[1]。镉污染对食品安全造成了极大的威胁。镉作为毒性最强的重金属之一,具有较强的化学活性，较易被植物吸收，农作物对镉的吸收和富集是其进入食物链的主要方式，镉可以通过食物链在人体内富集，长期食用被镉污染的农作物将对人体健康造成严重影响。在细胞和分子水平，镉毒性体现在使蛋白质变性或失活、诱导氧化胁迫、染色体畸变、细胞周期和细胞分裂的改变[24]。有报道显示, 在我国镉污染土壤面积大约为一万三千平方米, 土壤中镉含量达1～10mg/kg, 农产品镉超标率超过10%, 对人类健康造成了巨大威胁[5,6]。
水稻作为世界上最重要的粮食作物之一，在全球范围内有近一半人口将稻米作为主食，同时水稻也是我国的第一大粮食作物,全国约有60%人口将其作为主食。在这样的情况下，水稻自然成为了人类最大的镉吸收源之一。我国稻米镉污染的现象严重,危害了广大人民群众的健康,研究水稻镉污染具有重要的意义。此外，国外有关学者也对水稻抗重金属毒害机理及其分子遗传学进行了较广泛的研究[7,8,9]。因此，利用生物工程的手段筛选出水稻抗镉的基因，再利用转基因手段转入水稻内，赋予水稻更强的耐镉性，以适应镉毒害造成的逆境伤害，具有很大的发展前景。
在水稻中，耐镉基因的作用其一是促进镉与细胞壁的结合。细胞的细胞壁同镉的结合降低了细胞液中镉含量, 从而减少了镉对叶组织细胞内部的毒害。其二与转运蛋白相关。耐镉基因可以通过转运蛋白将镉运送到液泡中富集，以降低镉对植物体的伤害，达到耐镉的目的。因此，转运蛋白与镉离子的吸收、隔离和外排有着很大的联系，是水稻耐镉研究的一个热点。目前已从水稻中成功克隆了一批耐镉基因：阳离子扩散促进因子基因[10]、ATP结合盒转运蛋白基因[11]、锌铁转运蛋白基因[12]等,为从遗传水平上提高水稻品种耐镉性打下了基础。
本课题以日本晴水稻为材料，围绕验证水稻中参与镉诱导的胁迫的基因这一主题，利用酵母回补实验，将目的基因与载体相连，测序正确后转化酵母，通过比较转入耐镉基因的菌株、空载和野生型在含镉培养基上的长势来验证已从水稻cDNA文库中筛选出的耐镉基因是否确实具有耐镉性，从而阐明水稻中耐胁迫基因的作用机理。研究利用生物技术手段验证耐镉基因的作用，为后续耐镉的研究打下坚实基础，同时对水稻种耐镉基因作用机理有一定了解，继而拓展人们对水稻耐镉的作用机理的理解，而且对于利用分子生物学手段提高作物的抗逆性具有重要的指导意义。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 酵母菌株与载体
酵母菌株：yod、∆ycf1
载体及感受态：大肠杆菌E.coli DH5α、pYES2 Vector均购自 TaKaRa宝生物(大连)生物工程有限公司。
pYES2大小为5.9kb,作为载体，用于在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中表达重组蛋白。该载体包括几个主要的组成：①酵母GAL1可诱导启动子，驱动目的基因高水平表达。半乳糖诱导目的基因表达，葡萄糖阻遏目的基因表达，二者起到分子开关作用。②多克隆位点。载体上具备较多的限制性酶切位点，有利于基因插入。③CYC1终止子，有效终止mRNA的转录。④URA3基因。能够通过URA3基因能进行阳性选择和阴性选择。⑤氨苄抗性基因。选择性标记基因，有利于在大肠杆菌中进行载体筛选和扩增。pYES2载体的以上特点能保证基因蛋白的高效表达，并且有筛选作用，因此本实验选择将基因连接到pYES2载体上再转入酵母进行表达。pYES2的质粒图谱和多克隆位点信息见附录。
1．1．2 酶及主要试剂
LA Taq DNA聚合酶、GC buffer、RNA提取剂等均购自TaKaRa宝生物(大连)生物工程有限公司；限制性内切酶、DNA回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA Marker购自上海捷瑞生物工程有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1．1．3 主要仪器设备
恒温培养箱、AllegraTM64R 型高速冷冻离心机(Beckman)、TG16W型台式高速离心机(湖湘仪)，AllegraTM6R型水平离心机(Beckman)、水平摇床，HE120水平电泳槽（上海天能科技有限公司），DKS26型水浴锅（上海精密实验设备有限公司），PowerPac3000电泳仪(Biorad)、SWCJ1FD型超净工作台（苏净集团安泰公司），DEC810BS196型PCR仪（东胜创新生物科技有限公司）

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