水稻是世界主要粮食作物之一，水稻病害是阻碍水稻高产、稳产的重要因素。染色质重构蛋白是染色质重塑的主要调控者，可利用水解ATP 释放的能量改变染色质构型，进而调控基因的表达。水稻中有40个SNF2类染色质重构蛋白，它们中大部分蛋白的功能尚待研究。ISWI属于SNF2染色质重构蛋白中的Iswi亚类，被证明在拟南芥发育和核小体调控中起重要作用。本实验通过CRISPR/Cas9系统构建了ISWI基因OsCHR11的功能缺失突变体，观察到突变体出现了生长发育缺陷表型。通过对突变体植株接种水稻白叶枯菌PXO99之后的抗病性分析，初步证明OsCHR11基因是水稻抗病性的负调控因子，参与水稻抗病性调控的基因网络。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1 引言1
1.1 染色质重塑概述1
1.2 SNF2类染色质重塑蛋白概述2
1.3 CRISPR技术概述2
2 材料与方法3
2.1 材料3
2.1.1 转基因材料3
2.1.2 菌株与质粒3
2.1.3 非生物材料4
2.2 试验方法4
2.2.1 水稻愈伤组织培养4
2.2.2 载体构建5
2.2.2.1 筛选靶点5
2.2.2.2 引物设计5
2.2.2.3 PCR扩增5
2.2.2.4 建立酶连接体系5
2.2.2.5 转化产物筛选6
2.2.3 农杆菌转化6
2.2.4 纯和突变体的筛选鉴定6
2.2.5 抗病性状的鉴定6
3 结果与分析7
3.1 突变位点分析7
3.2 野生型与突变体生长表型比较7
3.3 OsCHR11以及抗病相关基因的表达分析8
3.4 Oschr11抗病表型分析 8
4 讨论8
致谢9
参考文献9
OsCHR11突变体的产生及其抗病表型鉴定
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引言
1 引言
水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的三大粮食作物之一，播种面积占世界粮食总面积的1/5，年产量占世界粮食总产量的1/4。目前我国约60% 的人口以水稻为主食[1]。水稻稳产及增产对保障我国粮食安全及国民经济的发展具有重要意义。然而，水稻在生长的过程中常会遭到白叶枯病、稻瘟病和纹枯病等病害的危害，给水稻产量造成严重损失。长期的生产实践证明，水稻抗病品种的选育和利用是防治水稻病害最经济有效的措施[2]。因此，挖掘在水稻抗病调控过程中起重要作用的基因，研究基因的作用机理，对培育水稻抗病新品种具有重要意义。
1.1 染色质重塑概述
真核生物的基因组DNA被组蛋白包裹、折叠形成染色质。染色质的包裹、折叠等构型的变化会影响RNA聚合酶、转录因子等基因表达调控因子与基因组DNA的结合，从而影响基因的表达[3]。作为染色质构型最重要的调控方式[3]，染色质重塑主要受组蛋白修饰酶和染色质重构蛋白(chromatin remodeling ATPase)调控[4]。染色质重构蛋白能够利用水解ATP获得的能量，通过松弛或收紧染色质结构、改变核小体在基因组上的排列及分布等方式，影响RNA聚合酶、转录因子等基因表达调控因子与靶标DNA序列的结合，从而调控基因的表达[5]。
1.2 染色质重塑蛋白概述
在遭遇病害时，植物不能通过改变位置来主动躲避病菌的危害，所以主要依赖抗病响应基因的表达调控来启动抗病防卫反应[6]。染色质重塑是通过表观遗传修饰调控基因表达的重要方式之一[3]，被证明在植物抗病响应基因的表达调控中发挥重要作用[12]。染色质重构蛋白，作为染色质重塑最重要的调控因子，广泛地参与了人、酵母、小鼠和果蝇等生物的逆境胁迫相关的基因表达调控[13]。
与人、酵母等生物相比，植物染色质重构蛋白功能研究目前还主要集中在生长发育调控方面[3, 8, 9]，有关染色质重构蛋白参与植物抗逆特别是抗病相关基因表达调控方面的研究还非常有限。有限的研究也主要集中在生长发育调控方面[10]，目前关于染色质重构蛋白参与水稻抗病性调控的研究更是鲜有报道。
水稻中有40个SNF2类的染色质重构蛋白[5]，到目前为止只有OsDDM1、OsCHR729、OsINO80、OsCRL6、OsALT1和OsBRHIS1(BITresponsive Histoneinteracting SNF2 ATPase 1)蛋白的功能被研究。OsBRHIS1是目前唯一一个被证明参与水稻抗病性调控的染色质重构蛋白。OsBRHIS1是水稻抗稻瘟病的负调控基因，沉默OsBRHIS1可显著提高水稻对稻瘟病的抗性[14]。在无病菌侵染时，OsBRHIS1通过直接与H2A和H2B组蛋白变体在抗病相关基因启动子区的结合来降低其泛素化水平，从而抑制抗病相关基因的表达；相反，病菌的侵染可抑制OsBRHIS1基因的表达，从而使抗病相关基因位点的泛素化水平增高，最终提高抗病相关基因的表达。
ISWI(Imitation Switch)属于SNF2染色质重构蛋白中的Iswi亚类。与其它SNF2染色质重构蛋白相比，ISWI除了含有保守的ATP 酶(ATPase)核心结构域外，在C端还含有一个由HAND、SANT和 SLIDE串联组成的三元结构域[11, 15]。随着基因组学的发展，越来越多的ISWI在不同植物中被发现[11,15]，但是到目前为止只有拟南芥ISWI在生长发育和核小体排布调控方面的功能被研究。拟南芥中的ISWI基因AtCHR11(CHROMATIN REMODELING 11)被证实在雌配子体发育[8]、开花时间[9]和花器官发育[16]等多种拟南芥生长发育调控过程中发挥重要作用。同时，拟南芥ISWI被证明能够调控全基因组水平核小体在基因编码区的均匀分布，且这一调控可能与基因表达有关[17]。从上述有关ISWI的已有研究结果中，我们可以看出，目前对于ISWI如何参与植物生长发育和核小体排布调控，已经有了较为系统的研究。相反，对于ISWI如何参与调控植物抗逆性还不清楚。

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