干旱胁迫导致一系列生理生化变化，最终将抑制大豆生长。Di19蛋白受非生物胁迫的诱导，在植物生长发育中起到关键的作用。为了研究GmDi19基因在干旱胁迫下的功能机制，本研究利用同源克隆的方法从大豆中获得了GmDi19基因。本研究，我们通过PCR扩增、连接、转化和测序，成功克隆得到该基因。然后进一步构建了大豆GmDi19基因的pGBKT7载体。研究大豆干旱诱导基因的功能将有利于以后改善大豆的抗旱性，也有助于了解大豆在干旱胁迫下其生长发育过程中的相关机理。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法4
1.1 大豆材料4
1.2 实验试剂4
1.3 RNA反转录cDNA4
1.4 目的基因克隆4
1.5 琼脂糖凝胶的回收纯化基因片段5
1.6 构建pEASYT1载体5
1.7 转化Trans1T1 Phage Resistant大肠杆菌感受态细胞6
1.8 pEASYT1载体菌液PCR扩增检验6
1.9 pEASYT1载体菌液送检测序6
1.10 pGBKT7载体的构建6
1.11 转化Trans1T1 Phage Resistant大肠杆菌感受态细胞7
1.12 pGBKT7载体菌液PCR扩增检验7
1.13 pGBKT7载体菌液送检测序7
2 结果与分析8
2.1 GmDi19基因PCR引物设计8
2.2 GmDi19基因克隆8
2.3 预测蛋白结构域8
2.4 GmDi19理化性质9
2.5 pEASYT1载体菌液PCR结果9
2.6 GmDi19基因测序结果10
2.7 亚克隆Di19基因PCR结果10
2.8 pGBKT7载体菌液PCR结果11
2.9 GmDi19::pGBKT7载体测序结果11
3 讨论12
3.1 GmDi19基因的扩增与克隆12
3.2 GmD *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: @351916072@ 
i19理化性质分析12
3.3 PCR扩增12
3.4 研究展望14
致谢14
参考文献14
附录 相关载体及感受态细胞简介16
大豆干旱诱导蛋白GmDi19基因的克隆及载体构建
引言
近年来，随着全球气候的变化，干旱胁迫对农业生产的影响越来越大，目前干旱缺水环境已成为制约农作物生产发展的重要因素。我国有近一半的国土面积处于干旱地区，该类地区空气干燥、地表蒸发量过大，在这样的条件下其降水量少、年降水量分配不均，因此给主要农作物生产带来了严峻的挑战[1]。
目前，中国大豆的种植面积和总产量处于萎缩的状态。主要因为在中国种植大豆的单产低，收益小，农民的种植积极性不高。但同时，大豆含丰富的营养价值，是我国重要的粮油原料兼用作物，也是人类食物中植物蛋白质的主要来源。现在中国已经成为大豆纯进口国且为世界最大的大豆进口国[2]，大豆作为我国重要作物，其耗水量较大。若生育期内缺水，大豆正常生长发育将受到一定影响且总产量也会萎缩。大豆育种已被列为国家科技攻关项目，而培育高产、稳产、优质的大豆品种则成为一个重要的育种目标。
干旱对农作物的伤害极大，主要表现在植物各部位间的水分重新分配、膜损伤、光合作用减弱等各方面，已经严重影响了作物的生长发育。大豆属于大田粮食作物其蛋白质和油料含量非常高，而对其抗旱性进行鉴定也非常重要，所使用的相关鉴定方法也基本上来源于田间。应对干旱胁迫，植物已进化出各种适应策论，根系通过伸长吸收水份，也可以通过体内胁迫基因表达进行的改变，渗透调节物质的积累和保护蛋白的增加等应对干旱胁迫。对大豆而言，干旱是一个极具威胁的逆境。大豆自身对抗旱性有相应的应对方案，不仅受自身的遗传因素的影响，还受大豆生长发育处在的外界环境的影响[3]，会受到田间小环境(如水分、天气或其他环境因子)的影响[4]。但是由于不可控因素太多，从而导致操作困难，很难达到预期目的[4]。室内鉴定环境容易控制，简单易操作，是一个良好的抗旱性初级鉴定方法。有研究表明，采用PEG胁迫人工模拟干旱胁迫环境，因此我们可以发现作物的抗旱性在同一作物不同时期、不同作物都会有不同的表现[511]，而且作物的抗旱性也会受到很多环境因素和遗传因子的影响，是由多个形态、生理、生化指标产生的综合反映。
干旱胁迫下，大豆的生理生化性质产生变化，植株长势和生物量也在发生变化，而最终对大豆生长产生影响，从而影响大豆产量[12]。因此，研究大豆干旱胁迫诱导基因的功能将有利于了解大豆在干旱胁迫下的一系列生理生化反应[13]，也有利于改善大豆的抗旱性，为选育大豆抗旱品种提供一定的理论依据[14]。
虽然植株也通过渗透调节物质保持细胞水分，但由于干旱对细胞膜脂过氧化造成的破坏比较大，植株生长受到很大的影响，使大豆长势变弱，生物量、产量也随之下降[15]。干旱胁迫使细胞膜遭受一定损伤，促使细胞膜脂质过氧化[16]。有研究表明，干旱胁迫会产生活性氧物质尤其是过氧化氢、超氧阴离子，在一定程度上改变细胞膜结构，大量离子外流。这种情况称之为膜脂过氧化，这一过程会加剧细胞膜渗透，加剧生物体在生长发育方面的伤害，并同时受到严重损伤，而膜脂过氧化程度则是通过MDA含量的高低来表现[17]。因此可以作为衡量作物细胞膜受损害程度的重要指标的就是该过程下的主要产物MDA。干旱胁迫下，大豆叶片气孔关闭，虽然植株的光合作用停止，但是其光呼吸作用增强，活性氧物质尤其是过氧化氢的含量增高[18]，在这一过程中值得注意的是，物质的变化已经超出了植物体自身清除能力，因此活性氧物质的增强就会对膜系统、抗氧化系统、呼吸链和DNA造成损伤。而干旱胁迫也可以诱导作为渗透调节的重要物质之一的可溶性糖(包括蔗糖、葡萄糖、海藻糖)的产生[19]，可溶性糖的含量越高，代表着渗透调节能力越强。大豆叶片在干旱胁迫下会显著降低气孔导度，影响蒸腾作用过程的CO2供应，使叶片净光合速率下降，也会减少大豆合成的相关代谢物[15]。在一定的水势变化范围内，生物体在干旱胁迫下可通过改变渗透势来维持细胞膨压。该条件下的叶片会产生大量的脯氨酸并累积，同时可以改变渗透调节能力的可溶性糖含量也在增加[20]。可溶性糖含量的增加会增强渗透调节能力，因此可以抵御干旱的影响[15]。植物体为了保证自身消除氧自由基的能力，一般在干旱胁迫下会保持较高的抗氧化酶(POD、SOD、CAT)的活性，而决定着保护酶系统的防御能力的关键还是在于这几种抗氧化酶的综合作用而产生的相关效应[17,21]。因此，干旱胁迫下MDA含量、还原糖和可溶性糖含量显著增加，对叶片POD、SOD含量无明显影响。可溶性糖含量的增加则表明，大豆通过调节渗透物质来保持一定的细胞水分；而MDA含量的增加则表明，在干旱胁迫下大豆加剧膜脂过氧化程度，渗透物质外流，植物的正常代谢将受到影响。

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