油菜是重要的油料作物，具有重要的经济价值。在油菜种植区，田间杂草问题已经成为全球性的重要危害，导致油菜的产量和品质下降，而目前克服田间草害最经济且有效的途径是施用化学除草剂和推广抗除草剂油菜。乙酰乳酸合成酶（ALS）抑制剂类除草剂是世界上应用最广泛的除草剂之一，具有生物活性高、杀草谱广、环境安全等优点。然而目前我国自主开发的抗ALS抑制剂类除草剂的油菜品种仍甚少，限制了此类除草剂的应用。本课题以江苏省农科院创制的抗ALS抑制剂类除草剂的非转基因油菜新种质M9为材料，通过蛋白质组学方法研究M9应答除草剂处理的代谢通路，挖掘抗性相关重要蛋白，对于阐明其抗性机理，培育抗ALS类除草剂作物具有重要意义。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1.1 试验材料 3
1.2 方法 3
1.2.1 样品采集 3
1.2.2 蛋白质样品的制备、鉴定及定量 3
1.2.3 iTRAQ标记 3
1.2.4 生物信息学分析 4
2 结果与分析 4
2.1 丰度差异蛋白鉴定结果 4
2.2 丰度差异蛋白GO注释分析 4
2.3 丰度差异蛋白KEGG富集分析 6
2.4 重要抗性相关蛋白 7
3 讨论 8
3.1 丰度差异蛋白鉴定 8
3.2 GO和KEGG富集分析 8
3.3 重要抗性蛋白 10
致谢 10
参考文献： 11
油菜抗ALS除草剂突变体的蛋白质组学初步分析
引言
引言
油菜田间杂草危害是影响油菜品质和质量的重要因素。杂草会与油菜争夺阳光、水分、地肥和生存空间等，影响油菜的开花、结果，最终导致油菜的产量和品质下降。此外，杂草出苗早、生长快，易传播病害，还会为病原菌和害虫提供寄生场所，在油菜长出后会感染病虫害。受杂草危害的油菜田产量一般会减少10%15%，严重的减产50%以上甚至绝收，严重降低了油菜的经济效益[1]。油菜种植户为了清 *51今日免费论文网|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
除杂草，需要花费大量的人力和资源，不仅耗时费力，还增加了成本，从而降低了油菜田的经济效益。油菜田间的杂草，经常与前茬作物有关，如稻茬油菜田杂草主要为禾本科，以看麦娘、稗草为主;旱地油菜田杂草主要为阔叶类杂草，以菊科、石竹科和十字花科为主，如牛繁缕、婆婆纳、猪殃秧、荠菜等[2,3]。草害在油菜的整个生长期间都有可能出现[4]，有些杂草从前茬作物就已经出现，若管理不善，就会持续到第二年的油菜苗期，严重影响油菜的整个苗期的生长。
乙酰乳酸合成酶简称ALS（Acetolactate Synthase），也被称为乙酰羟酸合成酶AHAS（Acetohydroxyacid Synthase）。ALS参与植物生长过程，是支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生物合成途径第一阶段的关键酶。ALS还与植物细胞分裂、光合产物运输和植物的死亡机制等有关，ALS抑制剂类除草剂通过抑制植物体内ALS来影响植物的生长[5]。ALS不存在于哺乳动物中，因此以ALS为靶标的除草剂对人体和动物安全性高[6]。此外，ALS抑制剂类除草剂还具有生物活性高、杀草谱广、选择性强、土壤残留低、对环境安全等优点，是全球应用最广泛的化学除草剂之一。现已开发的ALS抑制剂类除草剂约13类50余种，应用比较广泛的有磺酰脲类（Sulfonylureas，SU）、咪唑啉酮类（Imidazolinones，IMI）、三唑并嘧啶类（Triazolopyrimidines，TP）和嘧啶水杨酸类（Pyrimidinylthiobenzoates，PTB）等[6]。研究表明，创制抗除草剂新作物品种的费用仅相当于开发一个新除草剂费用的1％—5％，所以近20年来，培育抗除草剂作物新品种的工作发展迅速[7,8]。1982年美国杜邦公司成功研制出第一个磺酰脲类ALS除草剂[9]，其高效低毒的除草能力很快被全世界知晓。但由于ALS抑制剂类除草剂具有广谱性，喷施到油菜田中常把油菜小苗也一并杀死，故ALS类除草剂的使用和推广受阻，而培育抗ALS类除草剂油菜品种是解决这个问题的关键所在。
植物对ALS抑制剂类除草剂的抗性机制主要分为两种：一种是植物抗性生物型中的靶标酶基因发生点突变和靶标酶过量表达两种方式而产生抗性，合称为靶标抗性，其中点突变抗性涉及的基因单一、遗传方式简单、抗性程度高，便于抗性育种的利用；另一种是植物抗性生物型对除草剂的代谢解毒能力的提高而产生的抗性，为非靶标抗性[10，11]。靶标酶基因位点突变是植物对除草剂产生抗药性的主要原因。
已有的抗ALS抑制剂类除草剂突变体主要通过4种途径获得[7,12]：（1）自然突变：2004年高健芹等在油菜和大豆多年轮作的试验田中发现了抗IMI类除草剂的油菜自然突变株M9，且该突变体抗IMI类除草剂的浓度是该类除草剂有效杀草浓度的2倍[13]。（2）种子化学诱变：2002年美国氰胺公司利用种子诱变的方法获得小麦抗IMI类除草剂作物。（3）组织培养与花粉诱变：1992年先锋公司（Pioneer）利用组织培养、花粉诱变的方法获得玉米抗IMI类除草剂作物。（4）小孢子诱变与转基因：1997年美国氰胺公司通过小孢子诱变、转基因的方法获得油菜抗IMI作物。在抗ALS抑制剂的作物中主要属于抗SU类和抗IMI类。
自90年代初期的人类基因组计划开始，基因组学（genomics）成为研究热点，随后科学家又提出了后基因组计划，蛋白质组（proteome）的研究也成为重要的内容。蛋白质组学（proteomics）最早是在1994年由Marc Wikins[14]提出的名词，指一种基因组所表达的全套蛋白质。常用的蛋白质组学技术有iTRAQ、TMT、双向电泳、Labelfree、DIGE、SILAC等，其中，iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation)，即同位素标记相对和绝对定量技术，是近年来应用最广泛的差异蛋白质组学技术之一。iTRAQ试剂体外标记肽段，采用液质联用法定性和定量蛋白质，试剂盒中含8种同位素试剂，最多可同时分析8个样品的蛋白表达谱。iTRAQ技术可用来寻找丰度差异蛋白并分析蛋白的功能，可对一个基因组所表达的全部蛋白或一个混合体系中的所有蛋白质进行鉴定和分析[15]。iTRAQ技术具有高检测效率、测定蛋白范围广、适用范围广、定量精确、操作简单、试剂兼容性好等优点[16,17]，该技术的一般流程如图1[17]所示,主要包括：提取样品蛋白；样本还原、变性、胰蛋白酶酶解；iTRAQ试剂标记；混合对照和实验样品；强阳离子交换色谱纯化；液相串联质谱定性、定量分析多肽混合物。

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