灵芝是一种著名的食药用真菌，灵芝基因组测序的完成有效促进了人们对灵芝生长发育与次级代谢的研究。ATP合酶作为氧化磷酸化最后一个线粒体复合物，是ATP产生的主要途径，是控制细胞生长代谢关键酶之一。本研究通过对灵芝细胞中ATP合酶β亚基作RNAi沉默处理，分析ATP合酶对灵芝生长与代谢的影响，并发现ATP合酶β亚基沉默能够导致灵芝生长速度减缓，同时使灵芝酸的合成量减少。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1 材料 3
1.1.1 菌株和质粒3
1.1.2 实验相关引物3
1.1.3培养基3
1.1.4试剂与溶液4
1.1.5主要仪器设备4
1.2 方法 4
1.2.1灵芝菌株培养4
1.2.2 PCR扩增4
1.2.3酶连酶切体系6
1.2.4 DH5α感受态制备和转化6
1.2.5灵芝原生质体制备及脂质体转化7
1.2.6总灵芝酸测定7
1.2.7染色相关7
2 结果与分析7
2.1构建ATPsynbetapmi质粒7
2.2检测基因表达水平9
2.3检测菌丝生长情况9
2.4检测ATP变化趋势10
2.5检测灵芝酸变化趋势10
2.6检测ROS变化趋势11
3 讨论 12
致谢 12
参考文献13
ATP合酶β亚基沉默对于灵芝次级代谢影响的初步研究
引言
引言
灵芝[Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.]是一种既可药用，又可以食用的真菌[1]。灵芝的成分中有较多具有药用价值的部分，包含灵芝多糖、灵芝酸、生物碱等。
灵芝酸是灵芝中的一种主要活性成分，具有重要的药用价值。因此，对于灵芝酸的生物合成的研究具有重要的意义。不同的外界环境因素对灵芝酸的生物合成有影响。Zhang等人提出 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ￥351916072￥ 
了三阶段光照发酵法，他们发现光照强度与波长对灵芝酸合成具有影响[2]。Liu等人研究发现热胁迫会通过影响膜流动性影响次级代谢产物灵芝酸的生物合成[3]。影响灵芝相关基因的表达对于灵芝酸的合成也起到了重要的调节作用。前人研究发现过表达灵芝酸合成途径中关键酶基因hmgs可以提高了灵芝酸含量[4]。通过沉默与ROS相关的基因，例如谷胱甘肽过氧化物酶基因gpx，NADPH氧化酶基因nox，也会影响灵芝酸的生物合成[5] [6]。
ATP合酶是一种具有复杂结构的大分子蛋白质复合物（约500kDa）。它由膜嵌入部分Fo、中央茎、侧茎以及一个帽状结构组成。细菌ATP合成酶是一种简单又常见的构造。它由约380kDa的水溶性蛋白质复合物F1和疏水性跨膜部分Fo组成。其中F1包含5种亚基，化学计量为α3β3γ1δ1ε1，Fo含有三种跨膜亚基其化学计量为a1b2c1014？。跨膜螺旋的数量分别是五个（Foa），一个（Fob）和两个（Foc）。ATP水解时，β亚基是推动γε中央茎旋转的动力来源。β亚基的C端螺旋转角螺旋结构包含一个高度保守区域D环。D环作为推杆推动γ亚基旋转，从而带动ATP水解反应发生[7]。β亚基对底物ATP具有高选择性，可有效提高催化效率。研究发现β亚基对于不同核苷酸有不同亲和力，其大小为ATP/ADP＞GTP/GDP＞ITP/IDP[8]。
ATP合酶功能紊乱与多种疾病相关，并且各个亚基的功能好坏都与不同疾病相关，β亚基的功能异常会引发多种与代谢相关的疾病，如糖尿病、肥胖等。ATP合酶β亚基不仅与ATP代谢相关，还能成为感染性病原菌的结合靶点[9]。因此，研究β亚基在代谢中的作用显得尤为重要。
ATP合酶在大多数的真核生物细胞中起着重要功能，然而在灵芝细胞中ATP合酶β亚基对灵芝生长及灵芝酸合成的影响尚未进行研究。本研究通过沉默灵芝中ATP合酶β亚基，进而观察测量野生型的表型与沉默株间的差异来研究ATP合酶β亚基对灵芝生长及代谢的影响。结果显示当沉默ATP合酶β亚基后，灵芝生长受到了抑制，灵芝酸合成减少。并且，在进一步的研究中发现ATP合酶β亚基沉默会导致细胞内ROS含量下降，ATP合酶可能与呼吸链的其它部分存在一定关系。本论文通过进行灵芝ATP合酶在灵芝生长发育和次级代谢的作用分析，为对灵芝的生长代谢的系统研究提供重要的数据基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株和质粒
pMD19T、大肠杆菌E.coli DH5α、pGlcoi（pmi）质粒、灵芝G20菌株。
1．1．2 实验相关引物
表1 本文所用引物
Abbreviation
Sequence 5’3’
Description
ATPBETAIF
GTACggtaccCCATCAAGGGTGTCAAGC
Forward
ATPBETAIR
GTACactagtCTCCTCGTCACGGAAGTA
Reverse
RTATPBETAF
AGGTGTCTGCCCTGCTC
Forward
RTATPBETAR
TGATGGAACCCTTCTTGG
Reverse
1．1．3 培养基
LB培养基：
NaCl粉末 10 g、酵母粉10 g、蛋白胨5 g。
CYM培养基：
20% 葡萄糖、10% 麦芽糖、0.2% 蛋白胨、0.2% 酵母粉、0.05%MgSO4H2O、0.46%KH2PO4。

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/563618.html