本课题主要研究一种SEC1家族蛋白——VPS33蛋白在拟南芥主根液泡形态建成中的功能及其对主根生长发育的影响。通过构建VPS33 RNAi-16以及VPS33 RNAi-19突变体，我们发现VPS33 RNAi表达量明显下调。观察突变体植株主根表型，我们发现VPS33 RNAi-16和VPS33 RNAi-19的突变体主根长及根毛长均低于野生型。在不同细胞器Marker的定位分析中，发现液泡形态、自噬囊泡等均有异常。因此说明它们在液泡形态建成和主根发育过程中均发挥功能。本研究为了解VPS33 RNAi在主根细胞发育中的功能提供了更多的理论依据。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法5
1.1 材料 5
1.1.1实验材料5
1.1.2试剂的配置5
1.2 实验方法5
1.2.1 VPS33 RNAi植株的培养5
1.2.2 DNA的提取5
1.2.3 PCR扩增 6
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳6
1.2.5载体的构建6
1.2.6农杆菌转化7
1.2.7农杆菌侵染8
1.2.8 RNA的提取8
1.2.9 反转录反应8
1.2.10 Realtime PCR9
1.2.11与主根发育和液泡相关的Marker与VPS33 RNAi植株的杂交9
1.2.12 VPS33 RNAi植株中与主根发育和液泡相关的Marker定位观察10
2 结果与分析10
2.1拟南芥VPS33 RNAi植株中VPS33基因的表达分析10
2.2 VPS33 RNAi植株主根表型的光学显微镜观察10
2.2.1主根根长的光学显微镜观察10
2.2.2主根根毛的光学显微镜观察11
2.3 VPS33 RNAi植株主根细胞中不同细胞器Marker的定位分析12
2.3.1 MCHVAMP721的定位观察12
2.3.2  *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072# 
MCHVAMP711的定位观察13
2.3.3 YFPATG8e的定位观察13
3 讨论13
致谢14
参考文献15
拟南芥VPS33RNAi主根发育表型的研究
引言
液泡运输在拟南芥主根发育生长的过程中发挥着重要的作用，本研究选择研究Sec1 / Munc18（SM）蛋白家族的成员VPS33蛋白的生理功能，更多地了解SM蛋白家族，为主根生长发育的机制提供更多理论证据。
液泡是植物细胞中必不可少的细胞器，其动态性质对植物主根生长和发育表型很重要[1]。植物液泡是一种重要的细胞器，具有多种作用，包括多种材料的储存、细胞成分的再循环和降解、渗透调节、给花和果实着色以及填充细胞伸长的空间[2]。与这些复杂的功能相关，植物已经进化出独特的液泡运输机制[3]。例如，新合成的液泡蛋白通过多种转运途径转运至液泡，这些途径受不同于动物和酵母溶酶体/液泡运输途径的机制调节[4]。真核生物中液泡融合机制的已知组分包括SNARE蛋白，Rab GTP酶，磷酸肌醇以及HOPS（homotypic fusion and vacuole protein sorting）复合物。除真核生物共有的溶酶体、液泡功能外，植物液泡还具有独特的作用，如储存和着色：废物的降解和回收。为了实现这些复杂专门的功能，植物液泡运输通过多种独特调节的运输途径发生。
有实验表明HOPS复合物介导植物中的同型液泡融合[5]。HOPS对于酵母中液泡的融合[6,7]以及秀丽隐杆线虫[8]和人类[9]中溶酶体的融合非常重要。酵母HOPS复合物是最好的特征，由六个亚基形成。VPS39蛋白和VPS41蛋白是HOPS特异性的，而VPS11,VPS16，VPS18和VPS33蛋白形成“核心”并与CORVET（class C core vacuole/endosome tethering）共享，CORVET是一种在早期内体中起作用的系链复合物[10,11]。两种进化上保守的束缚复合物 HOPS [12]和CORVET，参与非植物系统中的溶酶体、液泡运输。尽管它们也存在于植物中，但几乎完全不知道这些束缚复合物如何调节植物液泡运输的独特方面。我们的研究结果为植物液泡运输系统的独特进化多样化提供了进一步的证据。
细胞器之间的物质转移是由载体囊泡介导的，所述载体囊泡从一个膜连续发芽并与另一个膜融合。在过去的几十年中，在确定维持和调节膜通量的分子机制方面取得了相当大的进展。每个囊泡运输反应可分为四个基本步骤，包括囊泡出芽，运输，束缚和融合，严格调节这些步骤以确保从供体隔室产生的囊泡被递送至其正确的受体隔室[13]。
液泡运输在真核生物的各种细胞活动和高阶功能中起关键作用，并且需要束缚因子来介导转运中间体和靶膜之间的接触。已知有两种进化上保守的连接复合物HOPS和CORVET在酵母和动物的液泡转运中起作用。两个复合体共同拥有由VPS11，VPS18，VPS16和VPS33组成的核心子复合体[14]。HOPS和CORVET亚基在模式植物拟南芥中也是保守的。然而，植物中的液泡运输通过多种独特的运输途径发生，并且这些保守的复合物如何介导植物中的内体液泡运输仍然是难以捉摸的。已有证据显示拟南芥HOPS亚基VPS33和VPS41蛋白在晚期内体中积累，并且VPS41蛋白通过渥曼青霉素敏感过程在液泡膜中积累。 VPS41和VPS33蛋白与脂质体结合，但这种结合被磷脂酰肌醇3磷酸抑制，这暗示了植物中HOPS募集的非保守机制。 VPS41蛋白的诱导性下调导致显著的液泡破碎表型，并证明了HOPS在液泡融合中的关键作用。目前已知道调节液泡融合的VPS41蛋白和VTI11 SNARE之间的遗传相互作用，以及正常VPS41和VPS33蛋白定位的功能性SNARE复合物的需求
CORVET和HOPS复合物是大型多蛋白机器，能够与内溶酶体途径的多种其他因子相互作用。在酵母中分离出的液泡蛋白分选（VPS）突变体的形态分析已被用于将VPS基因分为几类。有趣的是，发现CORVET和HOPS亚基的突变分为不同的类别：核心亚基VPS11，VPS16，VPS18和VPS33的突变显示最严重的表型。因为核心亚基（VPS11，VPS16，VPS18和VPS33）中的突变消除了CORVET和HOPS复合物，它们对液泡生物发生具有最严重的影响[15]。HOPS特异性亚基VPS39和VPS41的缺失导致空泡融合不足，导致多个较小的空泡。值得注意的是，CORVET亚基的缺失对液泡形态的影响非常小，可能是因为它们在液泡形成的上游起作用。酵母不依赖于内吞作用来存活，能够在没有HOPS和CORVET复合物的情况下存活。然而，高等真核生物中几乎所有这些基因的功能丧失突变都会导致致死性。

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