芽孢表面最外层蛋白——芽孢衣（crust）具有作为蛋白质展示平台的巨大潜力，目前许多研究都集中于芽孢表面构建蛋白融合表达载体上。为构建一个新型的芽孢表面展示系统，本文使用一种能够特异性识别SpyTag和BDTag并使其共价连接的连接酶SpyStapler，在验证SpyStapler体外连接活性的基础上，尝试将带有BDTag的荧光蛋白连接至带有SpyTag的芽孢表面。荧光显微镜的观测结果初步表明，目的蛋白被成功连接至芽孢表面。由此表明，利用SpyStapler构建芽孢表面展示系统具备一定的可行性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 培养基与试剂 2
1.2 供试菌株和质粒3
1.3 SpyStapler和含有不同Tag的CFP与YFP的异源表达5
1.3.1 spystapler，spytagcfp和bdtagyfp等基因的扩增5
1.3.2 表达载体的构建5
1.3.3 感受态细胞的制备6
1.3.4 重组菌株的诱导表达7
1.3.5 SpyStapler和含有不同Tag的CFP与YFP的纯化7
1.4 含有不同Tag的CFP与YFP的交联7
1.5 孢衣蛋白CotX/Y/Z与SpyTag的连接8
1.5.1 多个片段的融合8
1.5.2 B. subtilis 168感受态的转化8
1.5.3 芽孢的制备8
1.6 芽孢表面与外源蛋白的连接9
1.6.1 反应体系9
1.6.2 阴性对照9
2 实验结果9
2.1 含有不同Tag的CFP与YFP的连接反应9
2.1.1 九个表达载体的构建9
2.1.2 含有不同Tag的CFP和YFP的交联11
2.2芽孢表面与外源蛋白的连接12
2.2.1 孢衣基因cotX/Y/Zspytag的扩增12
2.2.2 芽孢表面与BDTagCFP的连接13 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: #351916072# 

3 讨论14
3.1 含有不同Tag的CFP与YFP的交联14
3.2 芽孢表面与目的蛋白的连接15
致谢15
参考文献16
附录17
新型芽孢表面展示系统的构建
引言
本质无序蛋白（intrinsically disordered proteins, IDPs）是指在生理条件下没有稳定二级结构的一类特殊的蛋白质[1]。虽然大多数蛋白质在执行生理功能时需要某些特定的构象，但这类没有稳定二级结构的IDPs也被证明是具有活性的，其在特定条件下亦可以作为活性酶来执行特殊的功能。最近，Wu等人[2]报道了一种功能强大的IDP——SpyStapler，这是一种连接酶，且不论在体外还是体内，它都能够催化SpyTag和BDTag这两种肽标签之间异肽键的形成。研究表明，尽管SpyStapler单独存在时呈现出无序的状态，但一旦有肽标签存在，它就能形成稳定的二级结构，且无论SpyTag和BDTag在蛋白质分子中的相对位置如何（N端，C端或肽链中间），它都能够催化这两个Tag进行高效地共价连接，氧化三甲胺（Trimethylamine Noxide, TMAO）的存在则可以进一步提高这一连接效率。
Wu等人[2]使用CD和NMR光谱测定的技术，进一步揭示了SpyStapler催化SpyTag和BDTag结合并形成异肽键的可能机制。他们的研究发现，SpyStapler介导的连接反应的典型二级速率常数约为（36±2）M1s1，这与大多数生物正交“点击”反应（bioorthogonal “click” reactions）相当。SpyStapler介导的这一高效连接机制为其在细胞中的应用提供了可能。此外，SpyStapler的无序性使其具备能够抵御各种灭活处理的能力，在8 M尿素或在100℃的条件下煮沸20 min仍然能够保持活性。显而易见，该工具的出现将对蛋白质工程，生物材料，化学生物学和合成生物学领域产生一定的影响。SpyStapler介导的共价连接体系的高反应效率和独特的稳定性为多肽多肽偶联以及蛋白质拓扑工程提供了新的工具。
在特定条件下，例如缺乏营养物质时，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis, B. subtilis）会在胞内形成不活跃的、抗逆性极强的内生休眠体——芽孢。它的核心包裹着DNA，外面由三个蛋白质层包裹[3][4]，保护它免受多种环境威胁。许多研究表明，芽孢最外层，即芽孢衣，具有作为蛋白质展示平台的巨大潜力[4][5]。
传统的蛋白质固定方法，是通过在合成材料表面上进行物理固定来实现的，这是一种耗时耗力、价格昂贵且蛋白纯化率较低的方法。与之相比，在生物表面上的自我固定（selfimmobilization）已经成为更为稳定、高效、经济的替代方法[6]。近年来，将枯草芽孢杆菌的内生孢子作为蛋白质展示平台的技术逐渐引起人们的关注。芽孢极强的抗逆性和它通过胞内产生蛋白质外壳的独特机制，赋予了它自我固定的潜力。研究人员可将目的基因导入孢衣蛋白基因中诱导它们进行融合表达，从而使得目的蛋白锚定在形成芽孢衣的蛋白质上[7][8]。由于不需要膜转运，该表面蛋白展示系统亦可以应用于某些不易分泌的蛋白质上。
Bartels等人[9]通过设计特定载体Sporovectors，导入目的基因，将目的蛋白的N端或C末端与六种孢衣蛋白（CotV，CotW，CotX，CotY，CotZ和CgeA）融合，在孢衣基因强启动子的控制下进行融合表达。他们的研究结果表明，强启动子PcotYZ控制下的CotY和CotZ是融合效率最高的锚蛋白，且N端更适合作为将蛋白质锚定到芽孢表面的融合位点。

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/563637.html