近年来，越来越多的研究表明线粒体复合物的功能缺陷会对动植物的生理代谢产生影响。实验室的前期研究证明线粒体复合物Ⅲ的沉默会增加灵芝三萜的生成量。线粒体复合物Ⅳ是线粒体电子传递链的关键复合物之一，在传递电子和产生质子梯度上具有重要的作用。本研究通过沉默灵芝线粒体复合物Ⅳ亚基Ⅰ的基因COXⅠ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ），检测线粒体复合物Ⅳ对灵芝三萜生成的影响。我们构建了pAN7-dual-COXⅠ质粒，通过脂质体转化进入灵芝菌株中，筛选沉默效率超过70%的COXⅠ沉默转化子，获得COXⅠ沉默的灵芝突变株，进而检测了灵芝在正常生长条件及热胁迫下其三萜含量的变化。结果表明，COXⅠ沉默菌株的灵芝三萜含量显著提高，对于研究灵芝三萜的合成途径和提高灵芝营养价值具有重要意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1引言2
1.1灵芝三萜概述2
1.2线粒体复合物Ⅳ的结构组成2
1.3线粒体复合物Ⅳ的功能3
2材料与方法3
2.1 主要菌株、仪器、药品和试剂3
2.1.1 菌株与质粒3
2.1.2 主要仪器4
2.1.3 药品试剂4
2.2 实验方法 4
2.2.1 DNA克隆实验4
2.2.2 菌丝相关实验6
3结果与分析8
3.1 线粒体COXⅠ基因克隆8
3.1.1 pAN7dualCOXⅠ质粒图谱8
3.1.2 pAN7dualCOXⅠ电泳检测9
3.2 COXⅠ基因沉默水平检测10
3.3 灵芝三萜含量检测11
4 讨论12
4.1 实验方法改进12
4.2 实验结果讨论12
4.2.1有关研究方法改进13
4.2.2 COXⅠ基因沉默与热胁迫条件增加细胞ROS含量从而影响灵芝三萜合成13
4.2.3 COXⅠ沉默导致乙酰辅酶A滞积从而增加灵芝三萜的合成13
4.3 实验展望14
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参考文献15
灵芝线粒体复合物Ⅳ沉默转化子的筛选及其三萜含量的变化
引言
1．1 灵芝三萜概述
灵芝作为一种药用担子菌，在治疗癌症、抗氧化、防衰老、降低血糖等具有一定的功效，而使灵芝发挥药效的主要成分之一是灵芝三萜。研究表明，灵芝三萜可调节癌症信号通路，抑制细胞周期和促进细胞死亡[1]。灵芝三萜抗癌的这个特点使人们更加重视灵芝三萜生成及其提取工艺，比如说通过限制培养基氮的含量促进三萜合成[2]，筛选高产灵芝三萜的菌种，用柱层析方法提取灵芝三萜等。目前已知羊毛甾醇是灵芝三萜的环状中间体，通过甲羟戊酸途径合成，乙酰辅酶A（CoA）做为底物，经过缩合反应，还原反应，磷酸化，脱羧反应后生成，但之后经过一系列的氧化反应，还原反应以及酰化反应，目前还未研究清楚。
1．2 线粒体复合物Ⅳ的结构组成
线粒体复合物Ⅳ也称为细胞色素C氧化酶，它的亚基是由细胞核基因组编码的亚基与线粒体基因组编码的亚基共同组成。不同生物复合物Ⅳ亚基组成存在一些差异。哺乳动物和鸟类线粒体复合物Ⅳ含有13个亚基，其中包括三个由线粒体基因组编码的核心亚基COXⅠ、COXⅡ和C0XⅢ[3]。植物线粒体复合物Ⅳ的亚基数目与哺乳动物一样，但是存在一个较大的区别是植物不完全是由线粒体基因组编码核心亚基，比如豆科植物的COXⅡ是核基因组编码，并且不同种属之间的复合物Ⅳ亚基组装过程存在较大差异 [4]。细菌的线粒体复合物Ⅳ亚基数量与哺乳动物相比较少，只有三至四个亚基，其中亚基Ⅰ、亚基Ⅱ的结构高度保守，作为核心亚基，传递氢离子，产生质子泵和还原氧分子[5]，而亚基Ⅲ没有氧化还原中心，协助复合物的组装和维持复合物稳定[6]。目前对于灵芝线粒体复合物Ⅳ的功能研究较少，但其亚基结构、功能可以参照同样为真菌的酵母，酵母线粒体复合物Ⅳ含有11个亚基[7]，其中COXⅠ、COXⅡ 和COXⅢ由线粒体基因组编码，作为核心酶的组成部分，包含催化所需的血红素和金属离子，催化电子的传递，使之从细胞色素C氧化酶传至氧分子中，促进质子泵的形成，核基因组编码的亚基与三个主要亚基紧密结合，协助线粒体复合物Ⅳ的组装[8]并调节它的生理活性，包括氧还原、产热和质子泵等[9]。从功能而言，不同物种间的线粒体复合物Ⅳ并没有很大的区别。
复合物Ⅳ的亚基数目与其他三个复合物相比较多，但其亚基结构较为脆弱不稳定，容易被活性氧自由基攻击，为了解决复合物Ⅳ结构易变特点，线粒体内复合物与复合物之间会发生相互作用形成更复杂更稳定的结构，称之为呼吸链超级复合物，以酵母为例，其线粒体内的复合物Ⅳ可与复合物Ⅰ和复合物Ⅲ相互结合[10]，提高能量代谢效率。
1．3 线粒体复合物Ⅳ的功能
线粒体复合物Ⅳ是线粒体电子传递链的终端复合物，负责把电子传至氧分子中，氧化还原反应释放能量使得复合物Ⅳ构象发生改变，氧化磷酸化和三羧酸循环产生的质子与被还原的氧气结合，生成两分子水，接着将能量储存在含高能磷酸键的ATP中，为机体提供能量。复合物Ⅳ基因的缺失或沉默会造成电子呼吸链的异常，氢离子无法正常传递，ROS累积，机体也无法得到足够的能量供应。
电子呼吸链的异常对于机体来说，弊端显然大于利端。复合物Ⅳ缺陷被认为是人类常见的线粒体疾病[11]，哺乳动物中编码COX4、COX6A亚基的基因在胎儿发育过程中会发生可变表达，生成其他异构体[12]，影响线粒体功能；COXⅢ 突变已被证明与阿尔兹海默症有关[13]；COX4b的敲除会使老鼠患上严重的呼吸道疾病，引发支气管炎[14]；Arnold S研究发现线粒体复合物Ⅳ COX5b表达量的下降，会使多聚谷氨酰胺发生聚集，从而导致SBMA（脊髓延髓肌萎缩症）疾病发生[15]；酿酒酵母线粒体复合物Ⅳ COXⅠ、COXⅢ的突变会阻断呼吸，降低细胞色素氧化酶的含量[6]。
但是呼吸链异常给机体带来麻烦的同时也为研究提供了契机。研究发现，AOX是维持细胞活性氧平衡的一个基因，AOX沉默菌株的灵芝三萜含量远高于野生型[16]；研究表明细胞线粒体产生活性氧的主要部位是复合物Ⅰ、复合物Ⅲ [17]，实验室的前期研究也发现复合物Ⅲ沉默的灵芝菌丝体与野生型相比具有较多的灵芝三萜。本实验为探究复合物Ⅳ基因沉默对灵芝三萜的生成量有何影响，选取了复合物Ⅳ的核心亚基COXⅠ，COXⅠ是全酶中最大的亚基，呈圆柱形，具有12个跨膜结构和高度的疏水性[18]，可以阻挡其他蛋白进入线粒体内，它含有2个血红素中心，Cyt a和Cyt a3，是发生氧化还原的场所，也是完成电子传递最重要的亚基。本文利用T载体方便检测，片段扩增突变率低的特点对COXⅠ进行扩增，并连接至本实验室用于沉默灵芝基因的特定载体pAN7dual，构建并筛选COXⅠ沉默菌株，最后测定菌丝体三萜生成量。

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