微生物与植物之间存在很多种关系，其中根瘤菌与植物根部互利共生则是一个典型的互利关系，根瘤菌在植物根部形成根瘤，从而为植物提供氮素营养。青枯菌作为一种植物病原菌，会侵入根部后在植物的茎部或者根部发病，使植物发病枯萎直至死亡。本实验以蒺藜苜蓿为实验材料，通过观察不同荧光标记的根瘤菌和青枯菌菌株的侵染与定殖情况来判断两者在植物体内的互作。通过使用激光共聚焦显微镜，我们首先观察到青枯菌存在于根瘤菌的侵染线中；其次在根瘤切片中，我们发现少数根瘤的表皮细胞间隙存在青枯菌，而多数根瘤内部仅有根瘤菌定殖，外部无青枯菌；茎部切片说明在植物导管附近仅有青枯菌定殖；结瘤动力学结果表明，青枯菌的侵染会影响根瘤形成时间，根瘤数量和形成速度；固氮酶活性测定说明了青枯菌对根瘤菌固氮的效率也会产生抑制效果。因此，青枯菌的侵染对根瘤菌的共生固氮过程产生抑制作用。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
供试材料 4
1.1.1 菌种 4
1.1.2 植物材料 5
1.1.3 培养基与培养条件 5
1.1.4 实验试剂耗材与仪器 5
1.2 实验方法 5
1.2.1 荧光菌株的活化与转接 5
1.2.2 稀释制备待接种菌液 6
1.2.3 蒺藜苜蓿的萌发、接种与接菌 6
1.2.4 蒺藜苜蓿结瘤动力学的检测 6
1.2.5 根瘤菌侵入线的观察 6
1.2.6 琼脂糖包埋切片法观察根瘤和茎部 6
1.2.7 根瘤固氮酶活性的检测 6
1.2.8 分菌计数 7
2 结果与分析7
2.1 蒺藜苜蓿结瘤动力学的检测 7
2.2 侵入线的观察 8
2.3 根瘤切片的荧光观察 9
2.4 茎部切片的荧光观察 12
2.5 根瘤固氮酶活性的检测 13
2.6 根瘤内菌的定殖情况 14
3 小结与讨论15 *景先生毕设|www.jxszl.com +Q: ^351916072^ 

致谢16
参考文献16
用荧光标记法观察根瘤菌和青枯菌在苜蓿上的互作情况
引言
引言
在物种进化的过程中，微生物与植物之间会形成多种互作关系，这些关系主要分为正向作用、中性作用和负向作用。正向作用包括对其中一种物种有利（偏利）或者是双方都有利（互利）的共生关系；中性作用是指两种物种间不存在联系或者联系不大；负向作用则是对一方或者双方都有害，例如捕食等方式。这些菌植互作方式对维持生物圈的稳定和繁衍，促进物种进化具有重要的意义。
根瘤菌与豆科植物在根部形成根瘤就是一个典型的互利共生关系的例子。根瘤菌是一类α和β纲细菌的革兰氏阴性土壤细菌，它能够通过在根毛中形成侵染线进入植物内部，在植物宿主细胞中分化为一种独特的类菌体，存在于特定的组织——根瘤中。在根瘤中，此类菌体通过固氮酶固定大气中的分子氮元素，可为豆科植物提供生长过程中所需要的氮素，而植物则会为类菌体提供生长必需的碳源，用于固氮所需能量[12]。根毛是研究植物细胞最好的器官，它们通过尖端生长过程伸长，根瘤菌能够吸附到根毛顶端被根毛卷曲包裹，形成一种管状结构，被称作侵染线，侵染线是从生长的根毛发育而来，在根部内部延长，能够穿过多个细胞层和分支到达根瘤原基处，被认为是尖端生长的结构[3]。随着根瘤菌的分化，被根瘤菌侵染的宿主细胞形成多倍体细胞，成熟的根瘤会持续固氮，这取决于周围的环境和植物的发育情况，随后根瘤会进入衰老阶段。结瘤和固氮是根瘤菌与宿主植物共生过程中的两个重要步骤，前期正常的结瘤，中期就可以稳定的固氮，稳定的与宿主植物维持这种互利共生的关系。在众多植物中与根瘤菌形成互利共生关系的大多为豆科植物，此类植物在我国一直都是重要的农作物植物，其中蒺藜苜蓿属豆科植物，是一种一年生草本植物，也被认为是研究豆科植物遗传学的模式植物，因其基因组小、二倍体、再生时间较短等特点被广泛用于研究中。
尽管结瘤对宿主植物有好处，但是过多的结瘤对于植物也是有害无益的，会影响宿主植物的正常生长，所以豆科植物会利用负反馈调节来解决这一问题，控制根瘤的过度生长[4]。宿主植物能够通过自身调控或反馈调节机制来控制结瘤数目的多少，这种调节被称作结瘤自调控（Autoregulation of nodulation, AON）。主要包括两种长距离信号途径，一种为根部信号，在根瘤菌在根部侵染然后扩散至茎部；还有一种为茎部信号，是指在茎部产生信号然后转运到根部从而抑制根瘤的过多产生。
青枯菌即青枯雷尔氏菌，是一种细菌性枯萎病的致病因子，是世界上最重要的细菌性疾病之一，也是最具特征的一种植物病原菌。青枯病难以防治，目前没有很好的方法防治该病，农作物一旦感病，将会造成农产品大量减产。该病原菌从植物根部开始入侵，通过维管束系统迅速向上扩张到寄主植物的地上部分，定殖后病菌大量繁殖会使植物导管功能丧失，从而引发植物枯萎直至死亡[56]。青枯病菌有多种方式进入宿主细胞，大多分为两种，一是经过土壤中植物感病组织的渗出物入侵宿主；二是经土壤灌溉直接进入宿主细胞。通常青枯菌是从植物的根部伤口或者次生根产生的自然裂口入侵[7]。
为了有效的防治植物青枯病，康丽华等人通过研究发现了弗兰克氏菌具有能够抑制青枯菌生长的作用，通过接种弗兰克氏菌，既能提高木麻黄苗木的共生固氮能力，又能有效的防治青枯病，由此指出了一条具有双重效果的生物防治新途径[8]。国外的一些研究也证明了，通过泡囊丛枝状菌感染的番茄根围的菌根提取物也能够有效的抑制青枯病的发病几率，而且还会降低发病的严重性[9]。由此引发猜想，接种了根瘤菌的蒺藜苜蓿植物，是否也能有效的防治青枯菌的感染。Fabienne Vailleau等人实验证明豆科植物蒺藜苜蓿A17易受致病性强的青枯菌的侵染，使其呈现枯萎症状[10]。
基因标记技术在植物互作研究中有着非常广泛的应用，本实验将以蒺藜苜蓿为实验材料，按不同时间点接种不同荧光标记的根瘤菌和青枯菌，根瘤菌标记绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP），青枯菌标记红色荧光蛋白mcherry，在激光共聚焦显微镜下观察两种菌在苜蓿中的定殖情况，以研究两种微生物在同一宿主中相互作用情况。
1 材料与方法

原文链接：http://www.jxszl.com/swgc/smkx/563646.html